Хімічний синтез генів (метод Корана) та його недоліки.

Гени, які потрібні для експериментів, синтезують штучно або виділяють з бактеріальних клітин за допомогою трансдукуючих фагів.

У 1968 р. X. Корана вперше синтезував ген аланінової тРНК. На той час структурні формули багатьох тРНК були вже відомі завдяки роботам американського біохіміка Р. Холлі (Нобелівська премія, 1968 р.) та інших дослідників. Виходячи з нуклеотидної послідовності аланінової тРНК, X. Корана спроектував на папері структуру гена, з якого вона транскрибується, а потім синтезував його.

Обидва комплементарні ланцюги гена, кожен довжиною 77 нуклеотидів, були розбиті на блоки від 8 до 12 нуклеотидів завдовжки. Блоки синтезувалися методами класичного органічного синтезу. Для з'єднання їх використовувався фермент ДНК — лігаза. Він здійснює репарацію розривів ланцюгів молекули ДНК, каталізуючи з'єднання фосфату одного нуклеотиду з цукром іншого (рис. 97). Успішне з'єднання блоків забезпечувалося також і тим, що вони мали «липкі кінці» — одноланцюгові комплементарні виступи, які, спарюючись між собою, утримували фрагменти разом для того, щоб лігаза проявила свою дію. Синтез гена був справжнім тріумфом біоорганічної хімії та молекулярної біології. Однак синтезований ген не проявив активності у живій системі.

Повна і функціонально активна генна структура (ген + регуляторна ділянка, всього 199 нуклеотидів) була синтезована X. Кораною в 1976 р. Штучно створений ним ген.тирозинової тРНК Е- соlі працював під час введення в геном фага Т4 в клітинах кишкової палички. Проте середній розмір гена становить 1000—1500 нуклеотидів, що значно ускладнює його синтез. Тому хімічний синтез застосовують тоді, коли продукт гена і сам ген має невеликі розміри. Так, методика, розроблена X. Кораною, застосовувалася для синтезу гена, який контролює синтез інсуліну в людини.

В Інституті біоорганічної хімії та Інституті загальної генетики (Москва) таким чином синтезували безліч генів, зокрема гени брадикініну і енкефаліну. Новосибірські вчені синтезували ген ангіотензину — невеликого білка, який складається з 10 амінокислот. Спочатку амінокислоти написали у тій послідовності, в якій вони розміщені в білку, і під кожною з них позначили відповідний кодон. Тобто одержали «проект» гена, а потім синтезували ген разом з регуляторними ділянками. Ген вмонтували в спеціально створену плазміду і ввели її в клітини Е. соlі. Штучний ген почав там працювати і забезпечив синтез нетипового для кишкової палички продукту — ангіотензину.

Лекція №3 (2 год)

План:

1. Зворотна транскриптаза (історія її вивчення і використання).

2. Ферментативний синтез генів.

3. Одержання блоків генів. Ферменти рестрикції – рестриктази та особливості їх дії на ДНК.

4. Лігази та дезоксинуклеотидилтрансфераза. Висновки.

5. Інші ферменти, що мають безпосереднє відношення до генної інженерії.