Кон'югація у бактерій.

У 1946 р. Д. Ледерберг і Е. Тейтем першими почали вивчати можливість рекомбінації генетичного матеріалу різних штамів бактерій під час сумісного їх культивування. З цією метою вони відібрали два множинних ауксотрофних штами Е. соlі. Один з них унаслідок накопичення незалежних мутацій втратив здатність до синтезу трьох життєво потрібних речовин, які ми умовно позначимо як А, Б, В, а другий – втратив здатність до синтезу трьох інших метаболітів – Г, Д, Е. Кожен з цих мутантів міг рости і утворювати колонії лише тоді, коли в поживне середовище додавали три певних речовини.

Бактерії обох штамів змішували і висівали разом на повне середовище, яке містило всі шість потрібних речовин. Через деякий час суміш клітин обох штамів для виявлення прототрофних рекомбінантів переносили на мінімальне середовище, де не було жодної з цих речовин. Однак на мінімальному середовищі утворилося кілька колоній бактерій. Припущення про те, що прототрофні бактерії (А⁺Б⁺В⁴Т⁺Д⁺Е⁺) виникли шляхом мутацій, було впевнено відкинуте тому, що одночасове виникнення трьох мутацій від ауксотрофності до прототрофності в одній клітині є малоймовірною подією (ймовірність одноразового виникнення трьох мутацій дорівнює добуткові ймовірностей кожної з них). Враховуючи це, Д. Ледерберг і Е. Тейтем дійшли висновку, що утворення прототрофних бактерій є наслідком рекомбінації генетичного матеріалу обох мутантних штамів:

1-й штам А^–Б^–В^–Т⁺Д⁺Е⁺

2-й штам А⁺Б⁺В⁺Г^–Д^–Е^–

Прототрофні А⁺Б⁺В⁺Г⁺Д⁺Е⁺

рекомбінанти

Перекомбінація генів, як показали додаткові досліди, не була наслідком трансформації: під час додавання до культури одного штаму стерильного фільтрату середовища іншого штаму рекомбінанти не виникали. Не було їх і тоді, коли штами культивувалися в окремих колінах U-подібної трубки, розділеної бактеріальним фільтром. Лише безпосередній контакт між бактеріями під час сумісного культивування їх на повному середовищі забезпечував утворення прототрофних клітин, які виявили ознаки обох вихідних штамів.

У 50-х роках Б. Хейс встановив, що в бактерій, здатних до кон'югації (взаємного зближення і утворення цитоплазматичного місточка), спостерігається полярність, тобто диференціація на статеві типи: один із партнерів кон'югуючої пари є донором («самцем»), а другий – реципієнтом («самкою»). Б. Хейсом були виділені два статевих типи: F⁺ – донорні, «чоловічі» штами і F^– – реципієнтні, «жіночі» штами.

У 1956 р. Д. Ледерберг одержав прямі електронно-мікроскопічні докази утворення кон'югаційних пар у змішаних культурах рекомбінуючих штамів (рис. 77). По тонкому цитоплазматичному містку, який з'єднує дві кон'югуючі бактерії, відбувається перенесення генів в одному напрямі – від донора до реципієнта. Детермінант, який визначає статевий тип і кон'югацію у Е. соlі, був названий фактором фертильності–F. Штами, які його мають, можуть бути донорами генетичного матеріалу для тих штамів, у яких він відсутній (перші позначають як F⁺-, а другі як F^–-штами)

Дослідження, проведені на молекулярному рівні, показали, що фактор F є автономною дволанцюговою, замкненою в кільце молекулою ДНК, здатною до реплікації. Такі самостійні, невеликі кільцеві молекули ДНК, які існують незалежно від основної хромосоми бактерій і становлять собою окремий реплікон, були названі плазмідами. Плазміди – це не обов'язкові компоненти клітин прокаріотів, які можуть передаватися іншим клітинам під час кон'югації. Схема передачі бактеріальної плазміди показана на рис. 78. Перед кон'югацією кожна з бактеріальних клітин (рис. 78, а) містить кільцеву хромосому (зображена лініями середньої товщини), а одна з клітин – донор – має ще й плазміду – невелику кільцеву молекулу ДНК, зображену товстою і тонкою лініями.

Під час кон'югації один з ланцюгів плазміди зображений у вигляді стрілки розривається в певній точці і через цитоплазматичний місток входить у клітину-реципієнт. Після цього на кожному з ланцюгів синтезується комплементарний ланцюг ДНК, завдяки чому утворюються дві інтактних молекули і обидві клітини внаслідок цього будуть містити по плазміді і стануть потенціальними донорами F⁺.

На одну бактеріальну хромосому донора припадає 1–2 кон'югаційних плазміди, які переносяться від клітини до клітини за описаною схемою. Проте в деяких випадках F-плазміда включається в бактеріальну хромосому.Під час цього хромосомна і плазмідна кільцеві молекули ДНК розриваються у певному місці, і ДНК плазміди шляхом кросинговеру петлеподібно вмонтовується в хромосому бактерії, наприклад між генами х, y, z і а, b, с. Завдяки такій інтеграції виникають клітини і штами Hfr (high frequency of recombination) з високою частотою рекомбінацій. Коли клітина Hfr (4) кон'югує F^–-клітиною, один ланцюг кільцевої хромосоми розривається в сайті інтеграції і фактор F, як локомотив, тягне за собою один з ланцюгів бактеріальної хромосоми.

Таке перенесення генів відбувається часто, і штами такого типу цілком виправдовують свою назву Hfr. Цитоплазматичний місток між кон'югуючими бактеріями є не міцним і може зруйнугатися спонтанно. Тому здебільшого реципієнт одержує не всю хромосому донора, а лише її частину, яка примикає до місця інтеграції.

Ф. Жакоб і Е. Вольман (1957), вивчаючи кон'югацію і її генетичні наслідки, істотно вдосконалили методику досліджень і зробили значний внесок у розуміння цього процесу. Із змішаної культури двох кон'югуючих штамів вони через певні проміжки часу після початку кон'югації брали проби і струшували їх у змішувачі Уорінга. Цитоплазматичний місточок між клітинами руйнувався, і кон'югація припинялась.

Після струшування, часом проведення якого регулювали тривалість кон'югації, проби висівали на селективне середовище і аналізували реципієнтні клітини на наявність генів та ознак донора. Виявилось, що кількість генетичного матеріалу, переданого реципієнту, пропорційна часові кон'югації.

Е. Вольман і Ф. Жакоб показали, що перенесення генів починається з початкової точки 0 і відбувається в певній послідовності (на рисунку: О, А, В, С, D, ..., К).

Рекомбінанти за геном В, наприклад, були виявлені після 15, а за геном С – після 20 хв кон'югації. Якщо перенесення ДНК відбувається з постійною швидкістю на одиницю її довжини, то час, потрібний для переміщення певного гена в клітину-реципієнт, може бути мірою відносної відстані між генами. Використовуючи часовий параметр як міру відстані між генними локусами, дослідники склали генетичну картину штаму HfrH.

Спрощену карту Е. соlі, на якій зображено відносне розміщення одинадцяти генних локусів, показано, де цифрами позначені відстані між генами в хвилинах.

Гени arg, thr, his, pur, ser, gly та ile визначають певну потребу в аргініні, треоніні, триптофані, гістидині, пурині, серині, гліцині і ізолейцині; lac, gal – гени, які контролюють здатність зброджування лактози і галактози; str – ген стійкості до стрептоміцину.

У 1967 році було опублікованоскладну і відносно повну генетичну карту Е. Соlі. Вона відбиває розміщення майже 250 генних локусів і є результатом численних дослідів, які були проведені багатьма вченими.

На сьогодні в кишкової палички нанесено на карту більше трьохсот генів. А в її геномі їх близько двох тисяч. За існуючою між дослідниками домовленістю геном Е. Соlі ділють на 90 „хвилин”. Так, на другій хвилині міститься ген azi, який визначає стійкість або чутливість до азиду натрію; на 18-ий – ген віо А , який визначає потребу в біотині; 64-ий – містить ген str A який зумовлюєстійкість або чутливість до стрептоміцину.