ГЛАВА 14. ния солнечной энергии; регенерации кофакторов, принимающих участие в промышленных ферментативных процессах; синтеза специфических химических соединений

Таблица 14.5. Рост растений и ассимиляция азота после введения генов hup в Нuр^–-штамм R. leguminosarum¹⁾

ния солнечной энергии; регенерации кофакторов, принимающих участие в промышленных ферментативных процессах; синтеза специфических химических соединений, требующего участия Н₂ в качестве восстановителя; для удаления трития из воды, которая использовалась для охлаждения реакторов атомных электростанций; для синтеза Н₂ из органических отходов; получения водородно-кислородных топливных ячеек. Однако, несмотря на то что уже идентифицировано и охарактеризовано более дюжины генов гидрогеназ, пока ни один из них не использовался для крупномасштабного синтеза этих ферментов.

Образование клубеньков

Конкуренция среди организмов, образующих клубеньки

Одна из основных задач сельскохозяйственной биотехнологии — создание с помощью методов генной инженерии штаммов Rhizobium, которые повышали бы урожайность растений более эффективно, чем природные штаммы. Многие имеющиеся на рынке штаммы-инокуляты -превосходные азотфиксаторы — были созданы путем мутагенеза и последующего отбора, однако они в недостаточной степени стимулируют образование клубеньков на корнях растения-хозяина в условиях конкуренции с природными штаммами Rhizobium, уже присутствующими в почве. И наоборот, многие природные штаммы с успехом выдерживают конкуренцию с лабораторными штаммами, но малоэффективны в отношении фиксации азота. Таким образом, для того чтобы можно было реально использовать имеющиеся на рынке инокулирующие штаммы, необходимо либо повысить их способность образовывать клубеньки, либо устранить природные штаммы Rhizobium.

Были проведены исследования, направленные на определение генетической основы «конкурентоспособности» природных штаммов, с тем чтобы затем попытаться ввести соответствующие гены в штаммы-инокуляты.

Манипуляции с генами образования клубеньков

Для идентификации генов образования клубеньков (nod-генов)вновь использовали генетическую комплементацию. Не способный образовывать клубеньки (Nod^~) мутантный штамм R. meliloti трансформировали банком клонов хромосомной ДНК R. meliloti дикого типа и выделяли колонии, приобретшие способность образовывать клубеньки на корнях люцерны (рис. 14.6). Стратегия заключалась в следующем.

1, С помощью частичного гидролиза ДНК R. meiiloti рестриктазой EcoRIи встраивания фрагментов длиной до 40 т. п. н. в уникальный EсоRI-сайт космиды рLАFR1 с широким кругом хозяев был создан банк клонов хромосомной ДНК R. meliloti дикого типа (Nod⁺).

2, Рекомбинантные плазмиды упаковали в частицы фага λ, ввели в Е. coli, a затем перенесли в клетки Nod^~-штамма R. meliloti при помощи конъюгации. Вектор содержал ген устойчивости к тетрациклину, который можно было использовать как селективный маркер и в случае Е. coli, и в случае R. meliloti.

3, После конъюгации суспензии, содержащие от 200 до 300 трансформированных клеток R. meliloti, проверяли на способность инициировать образование клубеньков у стерильных растений люцерны. Ожидалось, что этой способностью будут обладать только транс-

Бактерии,стимулирующие рост растений 317

Рис. 14.6. Идентификация генов образования клубеньков R. meliloti. ДНК R. meliloti дикого типа встраивают в космиду pLAFRI с широким кругом хозяев, упаковывают в частицы фага λ и вводят в Е. coli. Банк клонов переносят из Е. coli в Nod^~-штамм R. meliloti при помощи конъюгации. Растения люцерны инокулируют трансформированными R. meliloti Nod^~: растения, образующие корневые клубеньки, инфицированы A meliloti Nod⁺, клетки которых, по-видимому, несут комплементирующий ген образования клубеньков в составе космидного вектора. Из корневых клубеньков выделяют трансформированные Nod⁺-клетки R. meliloti.

318 ГЛАВА 14

форманты, которые несут и экспрессируют ген, комплементирующий дефект образования клубеньков в клетках R, meliloti.

4. Из клубеньков выделили бактерии, вызывающие образование клубеньков, а из бактерий -вектор, несущий комплементирующий ген. Содержащую этот ген большую вставку переклонировал и и провели дальнейший анализ,

5. Идентифицированный ген образования клубеньков использовали в качестве зонда для обнаружения фланкирующих его участков хромосомной ДНК R. meliloti в геномной библиотеке.

В результате этих весьма трудоемких экспериментов удалось охарактеризовать весь набор генов образования клубеньков R. meliloti. Детальные биохимические и генетические исследования показали, что образование клубеньков и его регуляция — это сложные процессы, в которых задействованы продукты большого количества генов (примерно 20; табл. 14.6). Одни

из этих генов высококонсервативны (одинаковы у всех микроорганизмов, образующих клубеньки), другие видоспецифичны. Их можно сгруппировать в три отдельных класса: консервативные, видоспецифичные и регуляторный ген nodD. Так, nodABC-гены одинаковы у всех видов Rhizobium и структурно взаимозаменяемы; у большинства видов они образуют один оперон.

Установлено, что процесс образования клубеньков включает несколько этапов. Сначала продукт конститутивно экс премирующегося гена nodD связывается с молекулой флавоноида, секретируемого клетками корней растения-хозяина. Флавоноиды — это растительные фенольные соединения, структурную основу которых составляют два ароматических кольца, соединенных друг с другом трехуглеродным мостиком. Они выполняют в растениях разные функции, в частности отвечают за их пигментацию и участвуют в защите от грибов и насекомых. Связывание флавоноидов с белком NodD -

Таблица 14.6. Некоторые белки, кодируемые генами образования клубеньков Rhizobium, и их возможные функции
Белок	Характеристика ¹⁾
NodA	Консервативен, локализован в плазматической мембране, вместе с NodB стимулирует клеточное деление
NodB	Консервативен, локализован в плазматической мембране, вместе с NodA стимулирует клеточное деление
NodC	Консервативен, локализован в наружной мембране, хитинсинтаза
NodD	Консервативен, активатор транскрипции, синтез конститутивен
Nod E	Локализован в плазматической мембране, ß-кетоацилсинтаза
NodF	Локализован в цитоплазме, ацилпереносящий белок
NodG	Ввдоспецифичен, дегидрогеназа
NodH	Вцлоспецифичен, сульфотрансфераза
NodIJ	Консервативен, локализован в плазматической мембране, участвует в секреции полисахарида оболочки
Nod К	Влияет на инициацию образования клубеньков некоторыми штаммами Bradyrhizobium
NodL	Локализован в плазматической мембране, ацетилтрансфераза
NodM	D- глюкозаминсинтаза
NodN	Функция неизвестна
NodO	Секретируется, гемолизин
Mod P	Комплекс с NodQ, АТР-сульфурилаза
NodQ	Комплекс с NodP, АТР-сульфурилаза
NodS	Метилтрансфераза
NodT	Локализован в наружной мембране, участвует в ceкреции
NodU	Функция неизвестна
NodX	Видоспецифичен
¹⁾ Если биохимические или генетические данные о функции белка отсутствуют, то ему приписывают такие же функции, как у белка с гомологичной аминокислотной последовательностью. Pазные штаммы Rhizobium содержат разные наборы этих белков. Слово «консервативен" означает, что белок выполняет одинаковую функцию у всех видов Rhiizobium.

Бактерии, стимулирующие рост растений319

Идентификация генов образования клубеньков Rhizobium meliloti путем прямой комплементации Nod^–- мутантов

S. R. Long, W. J. Buikenia, F. M. Ausubel Nature 298: 485-488, 1982

Идентификация гена в отсутствие гетерологичного зонда или какой-либо информации об этом гене — задача не из легких. В таких случаях часто приходится разрабатывать принципиально новую схему отбора. В ее основе может лежать иммунологическая идентификация искомого белка, определение его активности, ДНК-гибридизация с олигонуклеотидным зондом, нуклеотидная последовательность которого была определена исходя из данных о частично секвенированной аминокислотной последовательности очищенного искомого белка, или комплементация мутантов. Очень часто после идентификации гена, кодирующего определенную функцию, можно выделить аналогичные гены из других организмов, используя первый выделенный ген в качестве гетерологичного зонда для ДНК-гибридизации. Результативность данного подхода зависит от близости нуклеотидных последовательностей зонда и искомого гена. Эта стратегия оправдывает себя в случае консервативных в эволюционном плане генов, например генов, кодирующих белки, которые участвуют в фиксации азота, но в большинстве случаев она малопригодна.

Когда Лонг и др. решили идентифицировать гены образования клубеньков из Rhizobium meliloti, ни одного подобного гена охарактеризовано не было. Практически ничего не было известно о том, каким образом множество генов участвуют в этом процессе или какие белки они кодируют. Прежде чем идентифицировать гены образования клубеньков, эти ученые выделили и охарактеризовали несколько мутантов R. meliloti, не способных образовывать клубеньки. Однако эти эксперименты не дали исследователям ключ к объяснению функций указанных генов. Поэтому они попытались отобрать гены образования клубеньков, способные комплементировать полученных ими мутантов R. meliloti. Работа осложнялась еще и тем, что в то время банки клонов почти всегда создавали и поддерживали в Е. colt. Для создания банка клонов R. meliloti и его дальнейшего переноса в му-тантные штаммы R. meliloti, не способные образовывать клубеньки, исследователи для начала создали космидный вектор с широким кругом хозяев, в который можно было встраивать длинные фрагменты ДНК (при-

мерно 23 т. п. н.), стабильно поддерживающиеся в некоторых грамотрицательных бактериях. Благодаря большому размеру вставки увеличивалась вероятность того, что другие гены, участвующие в образовании клубеньков, будут находиться в одном фрагменте с комплементирующей последовательностью ДНК. После переноса косм ид при помощи конъюгации в R. meliloti трансформированные бактерии проверяли на способность вызывать образование клубеньков у люцерны. Проведенные ранее эксперименты показали, что даже одна бактерия, способная образовывать клубеньки, на фоне 10⁴ «дефектных» бактерий может вызвать образование клубеньков у растений люцерны. Бактерии с космияами, содержащими комплементирующую последовательность, выделяли непосредственно из клубеньков. Так были впервые идентифицированы гены образования клубеньков и разработана четкая и эффективная схема отбора. Сконструированный Лонгом и др. космидный вектор с широким кругом хозяев в дальнейшем неоднократно использовался в других работах.

один из ключевых моментов идентификации растения-хозяина, поскольку каждый вид Rhizobium узнает ограниченное число флавоноидных структур, а каждая разновидность растений синтезирует свой специфический набор этих молекул. Одни штаммы, например R. leguminosarum biovar (bv.) trifolii, имеют очень узкий круг хозяев, поскольку узнают только несколько видов флавоноидов, а у других штаммов, например у NGR234 Rhizobium sp., круг хозяев очень широк.

Присоединение молекул флавоноида активирует белковый продукт NodD, по-видимому, вызывая его конформационное изменение. Далее комплекс флавоноид—NodD связывается с промоторным участком генов образования клубеньков, называемым nod-блоком. Этот участок расположен перед всеми генами образования клубеньков, кроме гена nodD, и запускает их транскрипцию.

Гены nodABC кодируют белки, которые вызывают набухание и скручивание корневых во-

<49 50 515253 54 55 >

Дата добавления: 2015-07-14; просмотров: 608;