ГЛАВА 13. гены, поэтому проводят их дальнейшее изучение.

гены, поэтому проводят их дальнейшее изучение.

5. Чтобы доказать, что позитивные кДНК-клоны действительно кодируют целлюлазы, их ДНК. гибридизуют с суммарной мРНК индуцированных клеток, проводят трансляцию гибридизовавшейся мРНК in vitro в бесклеточной системе и идентифицируют полученные продукты с помощью антител, специфичных к ферментам целлюлазного комплекса,

6. Определяют нуклеотидную последовательность каждого позитивного кДНК-клона и устанавливают, какие клоны кодируют одинаковые, а какие — разные белки целлюлазного комплекса.

Эту схему можно использовать для выделения любых индуцибельных эукариотических генов.

Манипуляции с целлюлозными генами

Клонированные целлюлазные гены можно использовать в разных целях: для облегчения очистки рекомбинантных белков с помощью связывающего целлюлозу домена; для получения коммерческих продуктов (например, этанола) из целлюлозных отходов с помощью микроорганизмов, в которые встроены целлюлазные гены.

Молекула целлюлазы обычно состоит из трех доменов; каталитического, шарнирного, часто обогащенного остатками пролина, серина и треонина, и связывающего целлюлозу. Каталитический и связывающий домены функционируют независимо друг от друга. Такое разделение функций можно использовать, включив нуклеотидную последовательность связывающего целлюлозу домена в состав химерного гена, другая часть которого кодирует представляющий коммерческий интерес белок. Чтобы очистить полученный белок, его экстракт пропускают через колонку, набитую целлюлозой. С целлюлозой связывается только гибридный белок; его элюируют и удаляют «целлюлозный» домен протеолизом. Эта система сходна с иммуноаффинной хроматографией, но обходится дешевле.

Большинство целлюлазных генов исходно клонировали и экспрессировади в Е. соН, но их можно ввести в другие микроорганизмы и получить новые штаммы с полезными свойствами. Так, S. cerevisiae и Z. mobilis, эффективно преобразующие в этанол простые сахара (например, глюкозу) после введения им целлюлазных генов, могли бы превращать целлюлозу непосредственно в этанол. Для проверки этой гипотезы провели ряд исследований.

В одной из серий экспериментов гены эндо-и экзоглюканазы бактерии Cellulomonas fimi, каждый из которых находился под контролем промотора и сигнальной последовательности S. cerevisiae, субклонировали в плазмидном векторе и ввели в S. cerevisiae. Некоторые трансформанты секретировал и оба фермента в культуральную среду с эффективностью примерно 70% и частично расщепляли целлюлозу, входящую в состав фильтровальной бумаги и предварительно обработанных древесных стружек. Скорость и степень гидролиза этих субстратов возрастала при добавлении в смесь ß-глюкозидазы, расщепляющей целлобиозу до глюкозы, но полного гидролиза целлюлозы не происходило. Это связано с существованием двух регуляторных механизмов, действующих по принципу обратной связи: накапливающаяся целлобиоза ингибирует гидролиз целлюлозы, а глюкоза ингибирует расщепление целлобиозы. Ген ß-глюкозидазы выделили из грибов Trichoderma reesei, клонировали в мультикопийной плазмиде и вновь ввели в Т. reesei. Трансформированный штамм продуцировал ß-глюкозидазу в 5,5-кратном избытке и расщеплял производное целлюлозы авицел (Avicel) на 33% быстрее, чем нетрансформированный штамм. Это подтверждает данные о том, что ß-глюкозидаза облегчает ферментативное расщепление целлюлозы, и позволяет предположить, что для создания более эффективных целлюлолитических микроорганизмов нужно встроить в уже существующие штаммы гены ß-глюкозидазы.

Эндоглюканазные гены можно использовать не только для получения из целлюлозных отходов полезных веществ, но и для других целей. Если ввести ген эндоглюканазы, находящийся под контролем конститутивного промотора актинового гена дрожжей, в винные дрожжи, можно усилить аромат получаемого вина. Это связано с повышением содержания в нем как минимум 12 летучих соединений, в том числе

Биодеградация и утилизация биомассы 301

этилпропионата, 2-бутанола, изоамилацетата, изоамилонового спирта и изомасляной кислоты. С помощью такой генетической модификации можно стабилизировать процесс ферментации и создать такие штаммы дрожжей, которые будут производить вина с определенными свойствами.

Исследовалась также возможность использования целлюлазпри промышленной биопереработке бумажных отходов в этанол. Для этого отходы частично расщепляли целлюлазами при 45 °С, а затем, не удаляя целлюлаз, проводили ферментацию высвободившейся глюкозы с помощью S. cerevisiae при 37 °С. Основываясь на полученных результатах, рассчитали, что этот подход позволит получить 400 л этанола из 1 т бумажных отходов. Если все 100 млн. т бумажных отходов, ежегодно образующихся в Северной Америке, превратить в этанол и использовать его в качестве топлива, можно сэкономить примерно 16% бензина.

Белок одноклеточных организмов

Белок одноклеточных организмов (БОО) — термин, принятый для обозначения белковых продуктов, синтезируемых монокультурой микробных клеток и использующихся в качестве пищевых добавок или корма для скота. Вопрос об использовании микробной биомассы в качестве источника белка рассматривается вполне серьезно. Это связано не только с дефицитом продовольствия в общемировом масштабе, но и с тем, что содержание белка в большинстве микроорганизмов весьма велико: на его долю приходится примерно 60-80% сухой массы клетки. Кроме того, благодаря высокому содержанию метионина, лизина, витаминов и важных минералов БОО обладает более высокой пищевой ценностью, чем некоторые виды пищи растительного и животного происхождения. Но широкое применение БОО сдерживается по ряду причин,

• Высокое содержание нуклеиновых кислот, что может представлять опасность при некоторых патологических состояниях.

• Возможное присутствие в продуктах токсичных веществ, адсорбированных из субстрата

(например, тяжелых металлов) или вырабатываемых самим микроорганизмом (например, микотоксинов), и связанная с этим необходимость проведения дорогостоящих контрольных анализов.

• Низкая скорость разрушения микробных клеток в пищеварительном тракте, что может вызвать расстройство пищеварения или аллергические реакции.

• Более высокая стоимость БОО по сравнению с другими белковыми продуктами, например с белками сои.

Для получения БОО использовали многие микроорганизмы (бактерии, дрожжи, грибы, водоросли, актиномицеты) и различные субстраты (табл. 13.9). Впервые крупномасштабное производство БОО было налажено в Германии во время Первой мировой войны: на патоке в качестве источника углерода и солях аммония в качестве источника азота выращивали S. cerevisiae и добавляли их в супы и колбасные изделия для повышения содержания белка.

До 1973 г. нефть была довольно дешевым продуктом, а ее запасы считались практически неограниченными. В связи с этим сразу несколько крупных нефтяных компаний разработали проект по производству БОО из нефти и продуктов ее переработки. Но цены на нефть росли, и интерес к этим проектам пропал. В 1970-х гг. компания Imperial Chemical Industries (ICI) разработала непрерывный процесс ферментации метанола с помощью бактерии Methylophilus methylotrophus для коммерческого производства белка прутина. Эта бактерия использует метан (точнее, метанол) в качестве ос-

302 ГЛАВА 13

новного субстрата. В 1979 г. был построен завод с самым большим в мире работающим в непрерывном режиме эрлифтным ферментером, способным производить до 50 000 т БОО в год. Но несмотря на инвестиции ICI, составившие более 200 млн. долл., и серьезные инженерные и биотехнологические успехи, к 1987 г. на этой установке было произведено лишь незначительное количество БОО, поскольку его получение с помощью M. methylntrophus; оказалось невыгодным.

В последнее время интерес к БОО появился снова; теперь это связано с утилизацией различных отходов (например, целлюлозы и сыворотки), В одних случаях предполагается использовать природные микроорганизмы, и других - микроорганизмы, созданные методами генной инженерии. Но так или иначе, перспективы развития производства БОО будут определяться не природой микроорганизмов, а экономическими соображениями. Возможно, рентабельность производства удастся повысить, если БОО будут получать из побочных продуктов утилизации отходов. Для того чтобы разработать экономичный процесс производства БОО из отходов, необходимо изучить кинетику роста, метаболизм, возможности генетического манипулирования и безопасность многих микроорганизмов, а также вкусовые качества синтезируемых ими продуктов.

Разработан новый подход, с помощью которого можно будет обеспечивать крупный рогатый скот белком, обогащенным незаменимыми аминокислотами. Простое добавление белкок r корм — дорогостоящий и не особенно эффективный способ, поскольку белки и аминокислоты разрушаются бактериями рубиа еще до того, как животное успеет их использовать. Кроме того, основное количество белка они получают не с кормом; его поставляют присутствующие в рубце микроорганизмы. Рацион животных можно обогатить, если направленно модифицировать эти бактерии. Для этого сначала был синтезирован белок с высоким содержанием остатков метионина, треонина, лизина и лейцина. Он состоял из 100 аминокислот, 57 из которых были незаменимыми, и имел стабильную α-спиральную конфигурацию. Затем с помощью 14 частично перекрывающихся олигонуклеотидов синтезировали его ген и сшили его с геном белка, связывающего мальтозу; полученный гибридный ген экспрессировали в E. coli под транскрипционным контролем tac-промотора. На долю гибридного белка приходилось примерно 12% суммарного внутриклеточного белка. Теперь нужно выяснить, будет ли этот белок синтезироваться в достаточном количестве присутствующими в рубце бактериями. Если этот подход окажется успешным, то он станет основой уникальной системы непрерывного обеспечения крупного рогатого скота незаменимыми аминокислотами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биодеградация — это процесс разрушения микроорганизмами веществ, загрязняющих окружающую среду. Многие бактерии рода Pseudomonas несут плазмиды, кодирующие ферменты, которые катализируют расщепление ароматических и галогенсодержащих ограничкских соединений. В большинстве случаев одна плазмида содержит гены ферментов одного специфичного катаболического пути. Объединяя плазмиды разных штаммов Pseudomonas в одном хозяине, можно создать организм, способный к деградации нескольких соединений. Кроме того, с помощью генетических манипуляций можно расширить спектр субстратов, разрушаемых с помощью определенного ферментативного пути.

Под биомассой здесь понимается вся совокупность веществ и материалов, побочных продуктов пищевой и перерабатывающей промышленности, которая может служить сырьем для получения ценных продуктов. Производство этанола или фруктозы из молотого зерна происходит в несколько ферментативных стадий. Участвующие в этих процессах ферменты часто используются однократно. Чтобы повысить эффективность ферментативных реакций и снизить стоимость процессов, исследователи занимаются клонированием и исследованием свойств бактериальных генов, кодирующих термостабильные, обладающие высокой каталитической активностью и устойчивые к действию спирта ферменты,

Для повышения эффективности промышленного производства этанола в бактерию

Биодеградация и утилизация биомассы 303

Zymomonas mobilis были введены гены, благодаря экспрессии которых она могла использовать в качестве источника углерода широкий спектр соединений. Предприняты первые шаги на пути создания штаммов Lactobacillus plantarum, способных эффективно расщеплять крахмал, содержащийся в большом количестве в такой важной сельскохозяйственной культуре, как люцерна.

При переработке растительного материала часто образуется большое количество лигноцеллюлозных отходов, которые раньше не находили применения. Сейсас лигноцеллюлоза служит сырьем для получения углеродсодержащих соединений, в первую очередь глюкозы, которые можно использовать в других процессах. Лигноцеллюлоза — это комплекс из лигнина, гемицеллюлозы и целлюлозы, не подверженный действию ферментов без предварительной обработки. Проводимые в последнее время исследования были направлены в основном на изучение механизма расщепления целлюлозы с образованием глюкозы. Клонированы и охарактеризованы гены эндоглюканаз, экзоглюканаз и ß-глюкозидаз многих микроорганизмов, но пока не определен набор ферментов, осуществляющих масштабное эффективное расщепление целлюлозы in vitro.

Некоторые виды биомассы (например, сыворотка, целлюлозные отходы) и продукты переработки нефти могут служить субстратом при культивировании микроорганизмов. Предполагалось, что эти чистые культуры, а также их продукты (так называемый белок одноклеточных организмов, БОО) можно будет использовать в качестве пищевых добавок или корма для скота. К сожалению, вследствие дороговизны получаемых проуктов, их невысоких вкусовых качеств, а иногда и токсичности производство БОО оказалось экономически нецелесообразным. Однако есть надежда, что с помощью генетических манипуляций все-таки удастся создать систему, позволяющую получать дешевые биологические добавки на основе БОО.

ЛИТЕРАТУРА

Barnett С. С.1991. Cloning and amplification of the

gene encoding an extracellular ß-glucosidase from Trichoderma reesei: evidence for improved

rates of saccharification of cellulosic substrates. Bio/Technology 9: 562-567.

Beauregard M., C. Dupont, R. M. Teather, M.A. Ilefford. 1995. Design, expression, and initial characterization of MB1, a de novo protein enriched in essential amino acids. Bio/Techno-logy 13: 974-981.

Béguin P.1990, Molecular biology of cellulose degradation. Annu. Rev. Microbiol. 44: 219—248.

Brown D.E. 1983. Lignocellulose hydrolysis. Philos. Trans. R. Soc. Land. £300: 305-322.

Buchholz S. E., M. M. Dooley, D. E. Eveleigh.1987. Zymomonas—л\\ alcoholic enigma. Trends Biotechnol. 5: 199-204.

Buchholz S. E., D. E. Eveleigh.1990. Genetic modification of Zymomonas mobilis. Biotechnol. Adv. 8: 547-581.

Chakrabarty A. M.March 1981. Microorganisms having multiple compatible dcgradativc energy-generating plasmids and preparation thereof. U.S. patent 4,259.444.

Cole G. E., P. C. McCabe, D. Intow, D. H. Gelfand, A. Ben-Bassat, M. A. Innis.1988. Stable expression of AspergHlus awamori glucoamylase in distiller's yeast. Bio/Technology 6: 417-421.

Cork D. J., J. P. Krueger.1991. Microbial transformation of herbicides and pesticides. Adv. Appl. Microbiot. 36: 1—66.

Dekker K., A.Sugiura, H. Vamagata, K. Sakaguchi, S. Udaka.1992. Efficient production of ther-jvioftubi·:: Ί/ΐίτα··:^ 'fxrHH'/.'/ii'i'y xylose isomerase in Escherichia coli and Bacillus brevis. Appl. Microbiol. Biotechnol.36: 727-732.

Eveleigh D. E. 1987. Cellulase: a perspective. Philos. Trans. R. Soc. Lond. В 321: 435-447.

Fitzsimons Α., P. Hols, J. Jore, R. J. Leer,M. ü'Connell, J. Delcour.1994. Development of an amylolytic Lactobacillus plantarum silage strain expressing the Lactobacillus amylovorus oc-amylase gene. Appl. Environ. Microbiol. 60: 3529-3535.

Ghosal D., I.-S. You, D. K. Chattcrjee, A. M. Chakrabarty.1985. Microbial degradation of halogenated compounds. Science 228:135—142.

Click B. R., J. J. Pasternak. Î9S9. Isolation, characterization and manipulation of cellulase genes. BiotechnoL Adv. 7: 361-386.

Innis Μ.Α., M. J.Holland, P. C. McCabe, G. E. Cole, V. P. Wittman, R. Tal, K. W. K.Watt,