ГЛАВА 4. ся три фрагмента. Так называемое левое плечо (область L) содержит генетическую информацию о головке и отростке фага

ся три фрагмента. Так называемое левое плечо (область L) содержит генетическую информацию о головке и отростке фага, правое плечо (область R) ведает репликацией ДНК и лизисом, а средний сегмент имеет гены, ответственные за процессы интеграции и исключения (сегмент I/E, от англ. integration/excision). Задача исследователя состоит в том, чтобы заменить этот центральный участок нуклеотидной последовательностью длиной примерно 20 т. п. н. (рис. 4.17) нужной ДНК. ДНК, предназначенную для клонирования, тоже расщепляют с помощью ВатHIи выделяют фрагменты размером от 15 до 20 т. п. н. Оба препарата — фаговую и чужеродную ДНК — объединяют и добавляют ДНК-лигазу фага Т4, а затем — пустые головки и уже собранные отростки. Фрагменты ДНК длиной 50 т. п. н. упаковываются в головки, к ним присоединяются отростки и образуются инфекционные фаговые частицы. Фрагменты большего (>52 т. п. н.) или меньшего (<38 т. п. н.) размера упаковываться не могут. Рекомбинантный фаг λ может размножаться только в тех штаммах E. coli, которые не обеспечивают размножения фага λ с интактной областью I/Е. Для сохранения рекомбинантного фага λ его периодически пересевают на свежую культуру E. coli.

Для скрининга библиотек на основе фага λ можно использовать ДНК-зонды или иммунологические методы. Зоны лизиса (бляшки) переносят на фильтр и соответствующим образом тестируют. Если используется ДНК-гибридизация, то вначале удаляют фаговые белки, затем ДНК денатурируют и фиксируют на фильтре. При тестировании иммунологическим методом белки, кодируемые клонированными генами, переносят и фиксируют на фильтре вместе с бляшкой. Сопоставив пятна на фильтре, дающие положительную реакцию, с бляшками на исходной чашке, отбирают позитивные бляшки и проводят субкультивирование. Субкультуры служат источником рекомбинантных бактериофагов, которые можно по отдельности культивировать в E, coli.

Космиды

Векторы, называемые космидами, могут включать до 40 т. п. н. чужеродной ДНК и при этом активно амплифицироваться в E. coli как плазмиды. Космиды объединяют в себе свойства плазмидных векторов и векторов на основе фaгa λ. Например, широко применяемая космида pLFR-5 (приблизительно 6 т. п. н.) имеет два cos-сайта фага λ, разделенных сайтом рестрикции для ScaI, полилинкер с шестью уникальными сайтами рестрикции (HindIII, PstI, SalI, BamHI, SmaI и EcoRI), точку начала репликации ДН К (ori) и ген устойчивости к тетрациклину (Tet^r). Эта космида может интегрировать чужеродную ДНК длиной до 40 т. п. н. (рис. 4.18). Предназначенные для клонирования фрагменты ДНК длиной около 40 т. п. н. очищают центрифугированием в градиенте плотности сахарозы от продуктов частичного гидролиза донорной ДНК рестриктазой BamHI (рис. 4.18), a pLFR-5 сначала подвергают гидролизу с помощью ScaI, а затем ВатHI. Препараты ДНК смешивают и лигируют. Те продукты лигирования, которые содержат вставку длиной 40 т. п. н., имеют суммарный размер, близкий к 50 т. п. н., и следовательно, могут упаковываться in vitro в головки фага λ. Реассоциировавшие молекулы pLFR-5,

Рис. 4.18.Клонирование с помощью космидного вектора. Космида имеет точку начала репликации (ori), обеспечивающую ее существование в Е. coli в виде плазмиды; два интактных cos-конца, разделенных уникальным сайтом для ScaI: BamHI-сайт вблизи одного из cos-сайтов и ген устойчивости к тетрациклину (Tet^r). ДНК, которую хотят клонировать, расщепляют рестриктазой ВатHIи фракционируют по размеру, чтобы выделить молекулы длиной примерно 40 т. п. н. Плазммдную ДНК. расщепляют с помощью ScaIи ΒαmIII. Оба препарата ДНК смешивают и обрабатывают ДНК-лигазой фага Т4. Некоторые из гибридных молекул, образовавшихся после лигирования, содержат вставку размером около 40 т. п. н., так что их суммарная длина составляет примерно 50 т. п. н. Эти молекулы упаковываются in vitro в головки бактериофага λ, затем к головкам прикрепляются отростки, и образуются инфекционные частицы. При инфицировании этим «фагом» E. coli в бактериальной клетке оказывается линейная молекула ДНК с cos-концами, которые спариваются друг с другом. ДНК-лигаза клетки-хозяина зашивает одноцепочечные разрывы, и образовавшаяся кольцевая молекула существует в клетке-хозяине как автономно реплицирующаяся единица. Трансформированные клетки можно идентифицировать по признаку устойчивости к тетрациклину.

ТехнологиярекомбинантныхДНК 75