Особливості збору 2D-даних

Успіх будь-якого ЯМР експерименту в значній мірі залежить від правильності вибору параметрів, що визначають збір даних. У випадку 2D експериментів необхідно визначити параметри окремо для кожного виміру. Слід зазначити, що параметри, оптимальні для одного виміру, рідко підходять для іншого. Звичайно для одержання 2D-спектрів високої якості і за оптимальний час слід задати набагато більше параметрів, ніж для 1D-спектра.

При постановці експерименту треба відповісти на три основних запитання: 1) чи не перешкодить певний параметр одержанню необхідної інформації; 2) наскільки тривалим буде експеримент і чи досить для нього часу; 3) який об'єм пам'яті буде потрібний і чи є він у наявності. Ідеальним є швидке одержання результатів. Тому експеримент повинен передбачити максимальне скорочення часу збору даних і зручність їхнього аналізу. Насамперед слід визначити оптимальну спектральну ширину (SW). Для експерименту COSY вона повинна бути однаковою в обох вимірах. Для її мінімізації передавач настроюють так, щоб перекривався тільки необхідний спектральний діапазон. Найчастіше вдається зменшити спектральний діапазон до 10 м.ч., або менше. Використання занадто великого спектрального вікна веде до втрати цифрового розділення в кінцевому спектрі або вимагає більших об'ємів пам'яті. Спектральна ширина визначає також і частоту оцифровування даних по t₂, цілком аналогічно до 1D експериментів, і величину t₁-інкремента відповідно до критерію Найквіста. Час збору даних (AQ_t) і, відповідно, цифрове розділення (1/AQ_t) у кожному вимірі визначається наявною у них кількістю точок. Для t₂ це кількість точок даних у кожному сигналі СВІ. Для t₁ це кількість СВІ, накопичених у ході експерименту. Раціональний вибір цих параметрів - найбільш важлива складова успіху 2D-експерименту. Звичайно в 2D експериментах цифрове розділення і час збору даних істотно відрізняються від відповідних параметрів 1D експериментів. Як ілюстрацію наведемо параметри, що використовуються в 1D і 2D експериментах. При вимірюванні 1D спектра час збору даних може скласти 4 с, що відповідає цифровому розділенню 0,25Гц/точку, релаксаційний проміжок, як правило, відсутній. Наприклад, на спектрометрі з робочою частотою 400 МГц зі спектральним вікном 10 м.ч. таке цифрове розділення потребуватиме 32 К слів для збереження сигналу СВІ. Якщо ці параметри перенести на двомірний спектр і виміряти 16 К t₁-інкрементів, загальний час експерименту досягне 4,5 днів. Більше того, отримана в результаті матриця даних буде мати розмір близько 1000 мільйонів слів і зі звичайною комп'ютерною системою 32 біт/слово для її збереження буде потрібно 4 ГБайт дискового простору. Як бачимо, такі умови вимірювання двомірного спектру є неприйнятними. Якби неможливо було зменшити час експерименту, то спектроскопія COSY ніколи б не набула значного поширення.

Ключ до вирішення проблеми полягає в оптимізації кількості точок і обох вимірах. При цьому слід визначити заздалегідь, яке розділення в спектрі потрібне для успіху експерименту. Насамперед слід зазначити, що додавання додаткових точок у вимірі t₂ приводить до порівняно малого зростання тривалості експерименту, хоча розмір матриці даних при цьому зростає.

З іншого боку, додавання точок даних по t₁ вимагає запису додаткових СВІ, причому по декілька на кожний інкремент. Це приводить до значно більш істотного зростання часу збору даних. Тому необхідно, звести кількість інкрементів по t₁ до мінімуму, необхідному для достатнього розділення корисних кореляцій. При цьому для одержання більш високого розділення можна збільшити кількість точок по t₂. Із цієї причини цифрове розділення по f₂ зазвичай є набагато більшим, ніж по f₁. Зокрема, це справедливо і для фазочутливих експериментів. Використання малого часу збору даних (AQ_t1) є також кращим з погляду підвищення чутливості, оскільки в цьому випадку використовується лише початковий, найбільш інтенсивний фрагмент інтерферограми. Негативним наслідком використання недостатнього часу збору даних є обрізання частини t₁-даних. Тому для зменшення інтенсивності артефактів, пов'язаних з обрізанням спектра, потрібне застосування відповідної згладжувальної функції.

Зокрема для COSY одним з факторів, що обмежують рівень оцифровування наявних у спектрі протифазних кроспіків, є те, що при занадто грубому оцифровуванні, протифазні сигнали, що розташовані близько один від одного, можуть взаємно знищуватися. Рівень оцифровування залежить також від типу експерименту і від тих даних, які потрібно з нього отримати. Для COSY в абсолютних значеннях найбільший інтерес являє сама наявність кореляцій. Тонка структура піків при цьому є значно менш важливою. У цьому випадку можна використовувати рівень оцифровування, що є мінімально необхідним для фіксації кореляцій. Існує правило, відповідно до якого мінімальне розділення повинно становити від J до 2J на точку (в Гц) і, відповідно, час збору даних повинен дорівнювати від 1/J до 1/2J с. Ці параметри є достатніми для виявлення кореляцій, що мають величину J Гц або більше. Таким чином, для нижньої межі, скажімо 3 Гц, цифрове розділення повинне становити 3-6 Гц/точку (AQ~300-150 мс). Час збору даних для t₁ звичайно дорівнює половині часу збору даних для t₂. Оскільки кінцева матриця даних повинна містити однакову кількість точок в обох вимірах, для збільшення кількості точок у вимірі t₁ використовується один рівень нульового заповнення по t₁, тобто до масиву даних додають рівний йому масив нульових значень. При цьому загальне цифрове розділення в обох вимірах виявляється однаковим, як це і потрібно для симетризації.

При накопиченні даних у фазочутливому експерименті треба враховувати, що в цьому випадку основна інформація може міститися в мультиплетній структурі кроспіків. Для її адекватного подання потрібне більш високе цифрове розділення. Для більшості випадків необхідно мати розділення не гірше ніж J/2 Гц/точку. Для цього треба, щоб час збору даних AQ дорівнював 2/J с або більше. Ступінь оцифровування по t₂ у фазочутливих експериментах звичайно в 2 або навіть в 4 чи 8 разів вищий, ніж по t₁. Для того, щоб в обох вимірах масиву отриманих даних містилася однакова кількість точок, у вимірі t₁ слід використовувати відповідну кратність нульового заповнення. При цьому завжди слід пам'ятати, що тривалість періоду збору даних є природною межею розділення піків і ефективна ширина лінії після оцифровування не може бути меншою за нього. Загальним правилом є те, що для більш високого розділення потрібно більш тривалий період збору даних.

Визначивши прийнятний рівень оцифровування та об'єму даних, залишається вибрати кількість сканів для кожного СВІ та інтервал між сканами. Для цього вводиться спеціальний релаксаційний проміжок. Мінімальна кількість сканів визначається кількістю кроків у фазовому циклі, що використовується для виділення корисних сигналів. Для придушення артефактів, що пов'язані з недосконалістю імпульсів, можна вводити також додаткові скани. Оскільки більшість експериментів проводиться за стаціонарних умов, варто включати в експеримент також уявні скани. Вони подаються перед початком накопичення сигналу і служать для того, щоб спінова система під час всього експерименту перебувала у стаціонарному стані. У сучасних спектрометрах, що мають подвійний буфер пам'яті, уявні скани необхідні тільки на самому початку кожного експерименту. Тому їх використання дає дуже малий внесок у загальний час експерименту. На більш старих спектрометрах слід вводити уявні скани для кожного інкременту t₁. При цьому загальний час експерименту може істотно зрости. Час між сканами залежить від протонної релаксації Т₁ і, оскільки в програмах використовуються 90˚ імпульси для одержання оптимальної чутливості, імпульси треба подавати через 1,3 Т₁ с.

Вертаючись до наведеного вище прикладу накопичення сигналу на спектрометрі 400 МГц, ми тепер можемо визначити більш прийнятні критерії для вибору параметрів запису. У табл. 5.3 наведені вище результати порівнюються з більш реалістичними даними. З них стає зрозумілим, що експеримент COSY вимагає для свого проведення всього кількох години або навіть десятків хвилин. Введення імпульсних градієнтів поля в спектроскопію високого розділення дозволяє проводити експеримент із 1 сканом для кожного інкременту. При цьому сильно скорочується загальний час експерименту. Вимоги до збору даних при цьому не є дуже суворими, оскільки сучасні прилади оснащуються комп'ютерами з великим об'ємом пам'яті, здатними працювати з масивами даних великого об'єму.

Таблиця 5.3. Параметри збору даних для COSY експериментів