Физико-химические свойства белков.

Аминокислотный состав и пространственная организация каждого белка определяют его физико-химические свойства. Белки обладают кислотно-основными, буферными, коллоидными и осмотическими свойствами.

Белки как амфотерные макромолекулы

Белки являются амфотерными полиэлектролитами, т. е. сочетают в себе, подобно аминокислотам, кислотные и основные свойства. Однако природа групп, придающих амфотерные свойства белкам, далеко не та же, что у аминокислот. Кислотно-основные свойства аминокислот обусловлены прежде всего наличием a-амино и a-карбоксильной групп (кислотно-основная пара). В молекулах белков эти группы участвуют в образовании пептидных связей, а амфотерность белкам придают кислотно-основные группы боковых радикалов аминокислот, входящих в белок. Разумеется, в каждой молекуле нативного белка полипептидной цепи) имеется как минимум по одной концевой a-амино- и a-карбоксильной группе (если у белка только третичная структура). У белка с четвертичной структурой число концевых групп —NH₂ и — СООН равно числу субъединиц, или протомеров. Однако столь незначительное число этих групп не может объяснить амфотерность макромолекул белка. Поскольку большая часть полярных групп находится на поверхности глобулярных белков, то именно они определяют кислотно-основные свойства и заряд белковой молекулы.

Кислотные свойства белку придают кислые аминокислоты (аспарагиновая, глутаминовая и аминолимонная), а щелочные свойства — основные аминокислоты (лизин, аргинин, гистидин). Чем больше кислых аминокислот содержится в белке, тем ярче выражены его кислотные свойства, и чем больше входит в состав белка основных аминокислот, тем сильнее проявляются его основные свойства. Слабая диссоциация SН-группы цистеина и фенольной группы тирозина (их можно рассматривать как слабые кислоты) почти не влияет на амфотерность белков.

Буферные свойства.

Белки хотя и обладают свойствами буфера, но емкость их при физиологических значениях рН ограничена. Исключение составяют белки, содержащие много гистидина, так как только боковая группа пищит обладает буферными свойствами в интервале значений рН, близких к физиологическим. Таких белков очень мало. Гемоглобин чуть ли не единственный белок, содержащий до 8% гистидина, является мощным внутриклеточным буфером в эритроцитах, поддерживая рН крови на постоянном уровне.

Заряд белковой молекулы зависит от содержания в ней кислых и основных аминокислот, а точнее, от ионизации кислых и основных групп бокового радикала этих аминокислот. Диссоциация СООН-групп кислых аминокислот вызывает появление отрицательного заряда на поверхности белка, а боковые радикалы щелочных аминокислот несут положительный заряд (за счет присоединения Н⁺ к основным группам). В нативной молекуле белка заряды располагаютя асимметрично в зависимости от укладки полипептидной цепи в пространстве. Если в белке кислые аминокислоты преобладают над основными, то целом молекула белка электроотрицательна, т. е. является полианионом, и наоборот, если преобладают основные аминокислоты, то она заряжена положительно, т. е. ведет себя как поликатион.

Суммарный заряд белковой молекулы, естественно, зависит от рН среды: в кислой среде он положителен, в щелочной отрицателен. То значение рН, при котором белок имеет суммарный нулевой заряд, называется изоэлектрической точкой данного белка. В этой точке белок не обладает подвижностью в электрическом поле. Изоэлектрическая точка каждого белка определяется соотношением кислых и основных групп боковых радикалов аминокислот:

Чем выше соотношение кислые/основные аминокислоты в белке, тем ниже его изоэлектрическая точка. У кислых белков рН < 7, у нейтральных рН около 7, а у основных рН>>7. При значениях рН среды ниже его изоэлектрической точки белок будет нести положительный заряд, а выше — отрицательный заряд. Усредненная изоэлектрическая точка всех белков цитоплазмы лежит в пределах 5,5. Следовательно, при физиологическом значении рН (около 7,0— 7,4) клеточные белки имеют общий отрицательный заряд. Избыток отрицательных зарядов белков внутри клетки уравновешивается, как уже говорилось, неорганическими катионами.

Знание изоэлектрической точки очень важно для понимания стабильности белков в растворах, так как в изоэлектрическом состоянии белки наименее устойчивы. Незаряженные частицы белка могут слипаться друг с другом и выпадать в осадок.

Коллоидные и осмотические свойства белков

Поведение белков в растворах имеет некоторые особенности. Обычные коллоидные растворы устойчивы только в присутствии стабилизатора, который препятствует осаждению коллоидов, располагаясь на границе раздела «растворенное вещество — растворитель».

Водные растворы белков являются устойчивыми и равновесными, они со временем не выпадают в осадок (не коагулируют) и не требуют присутствия стабилизаторов. Белковые растворы гомогенны и, в сущности, их можно отнести к истинным растворам. Однако высокая молекулярная масса белков придает их растворам многие свойства коллоидных систем:

1) характерные оптические свойства (опалесценция растворов и способность их рассеивать лучи видимого света);

2) малая скорость диффузии;

3) неспособность проникать через полупроницаемые мембраны;

4) высокая вязкость растворов;

5)способность к образованию гелей.

Оптические свойства белков.

Растворы белков, особенно концентрированные, обладают характерной опалесценцией. При боковом освещении раствора белка лучи света в нем становятся видимыми и образуют светящийся конус или полосу—эффект Тиндаля (в сильно разбавленшях растворах белка не видна опалесценция и почти отсутствует светящийся конус Тиндаля). Объясняется этот светорассеивающий эффект дифракцией лучей света частицами белка в растворе. Считается, что в протоплазме клетки белок находится в виде коллоидного раствора — золя. Способность белков и других биологических молекул (нуклеиновых кислот, полисахаридов и т. д.) рассеивать свет используется при микроскопическом изучении клеточных структур: в темном поле микроскопа коллоидные частицы видны как светлые вкрапления в цитоплазме.

Светорассеивающую способность белков и других высокомолекулярных веществ используют для их количественного определения методом нефелометрии, сравнивая интенсивность светорассеивания взвешенными частицами исследуемого и стандартного золя.

Малая скорость диффузии.

Диффузией называется самопроизвольное перемещение молекул растворенных веществ в следствие градиента концентраций (от зон с высокой концентрацией к зонам с низкой концентрацией). Белки имеют ограниченную скорость диффузии в сравнении с обычными молекулами и ионами, которые перемещаются в сотни и тысячи раз быстрее, чем белки. Скорость диффузии белков больше зависит от формы их молекул, чем от молекулярной массы. Глобулярные белки в водных растворах подвижнее фибриллярных белков.

Диффузия белков имеет важное значение для нормального функционирования клетки. Синтез белков в любом участке клетки (там, где имеются рибосомы) мог бы привести при отсутствии диффузии к скоплению белков в месте их образования. Внутриклеточное распределение белков происходит путем диффузии. Поскольку скорость диффузии белков невысока, она ограничивает скорость процессов, зависящих от функции диффундирующего белка в соответствующем участке клетки.

Осмотические свойства белков.

Белки из-за высокой молекулярной массы не могут диффундировать через полупроницаемую мембрану, тогда как низкомолекулярные вещества легко проходят через такие мембраны. Это свойство белков используют в практике для очистки их растворов от низкомолекулярных примесей. Такой процесс называется диализом.

Неспособность белков диффундировать через полупроницаемые мембраны вызывает явление осмоса, т. е. перемещение молекул воды через полупроницаемую мембрану в раствор белка. Если раствор белка отделить от воды целлофановой мембраной, то, стремясь к достижению равновесия, молекулы воды диффундируют в раствор белка. Однако перемещение воды в пространство, где находится белок, повышает в нем гидростатическое давление (давление столба воды), которое препятствует дальнейшей диффузии молекул воды к белку.

То давление, или сила, которое следует приложить, чтобы остановить осмотический ток воды, называется осмотическим давлением. Осмотическое давление в очень разбавленных растворах белка пропорционально молярной концентрации белка и абсолютной температуре.

Биологические мембраны также непроницаемы для белка, поэтому осмотическое давление, создаваемое белком, зависит от концентрации его внутри и вне клетки. Осмотическое давление, обусловленное белком, называют также онкотическим давлением.

Высокая вязкость растворов белка.

Высокая вязкость характерна не только для растворов белка, но вообще для растворов высокомолекулярных соединений. С увеличением концентрации белка вязкость раствора повышается, поскольку повышаются силы сцепления между молекулами белка. Вязкость зависит от формы молекул. Растворы фибриллярных белков всегда более вязки, чем растворы глобулярных белков. На вязкость растворов сильно влияют температура и присутствие электролитов. С повышением температуры вязкость растворов белка снижается. Добавки некоторых солей, например, кальция, повышают вязкость, способствуя сцеплению молекул с помощью кальциевых мостиков. Иногда вязкость белкового раствора увеличивается настолько, что он теряет текучесть и переходит в гелеобразное состояние.

Способность белков к образованию гелей.

Взаимодействие между макромолекулами белка в растворе может привести к образованию структурных сеток, внутри которых находятся захваченные молекулы воды. Такие структурированные системы называются гелями или студнями. Считается, что белок протоплазмы клетки может переходить в гелеобразное состояние. Характерный пример — тело медузы является как бы живым студнем, содержание воды в котором до 90%.

Гелеобразование легче протекает в растворах фибриллярных белков: их палочковидная форма способствует лучшему контакту концов макромолекул. Это хорошо известно из бытовой практики. Пищевые студни готовят из продуктов (кости, хрящи, мясо), содержащих в большом количестве фибриллярные белки.

В процессе жизнедеятельности организма гелеобразное состояние белковых структур имеет важное физиологическое значение. Коллагеновые белки костей, сухожилий, хрящей, кожи и т.д. обладают высокой прочностью, упругостью и эластичностью, потому что находятся в гелеобразном состоянии. Отложение минеральных солей при старении снижает их упругость и эластичность. В гелеобразном или студнеобразном виде находится в мышечных клетках актомиозин, выполняющий сократительную функцию.

В живой клетке происходят процессы, напоминающие переход золь — гель. Протоплазма клетки представляет собой золеподобную вязкую жидкость, в которой обнаруживаются островки гелеподобных структур.

Гидратация белков и факторы, влияющие на их растворимость.

Белки — гидрофильные вещества. Если растворять сухой белок в воде, то сначала он, как всякое гидрофильное высокомолекулярное соединение, набухает, а затем молекулы белка начинают постепенно переходить в раствор. При набухании молекулы воды проникают в белок и связываются с его полярными группами. Плотная упаковка полипептидных цепей разрыхляется. Набухший белок можно считать как бы обратным раствором, т. е. раствором молекул воды в высокомолекулярном веществе — белке. Дальнейшее поглощение воды приводит к отрыву молекул белка от общей массы и растворению. Но набухание не всегда ведет к растворению, некоторые белки, например коллаген, так и остаются в набухшем виде, поглотив большое количество воды.

Растворение связано с гидратацией белков, т. е. связыванием молекул воды с белками. Гидратная вода так прочно связана с макромолекулой белка, что отделить ее удается с большим трудом. Это говорит не о простой адсорбции, а об электростатическом связывании молекул воды с полярными группами боковых радикалов кислых аминокислот, несущих отрицательный заряд и основных аминокислот, несущих положительный заряд.

Однако часть гидратной воды связывается пептидными группами, которые образуют с молекулами воды водородные связи. Например, полипептиды с неполярными боковыми группами тоже набухают, т. е. связывают воду. Так, большое количество воды связывает коллаген, хотя этот белок содержит преимущественно неполярные аминокислоты. Вода, связываясь с пептидными группами, раздвигает вытянутые полипептидные цепи. Однако межцепочечные связи (мостики) не дают молекулам белка отрываться друг от друга и переходить в раствор. При нагревании сырья, содержащего коллаген, межцепочечные мостики в коллагеновых волокнах разрываются и освобожденные поли пептидные цепи переходят в раствор. Эта фракция частично гидролизованного растворимого коллагена называется желатиной. Желатина по химическому составу близка к коллагену, легко набухает и растворяется в воде, образуя вязкие жидкости. Характерным свойством желатины является способность к гелеобразованию. Водные растворы желатины широко используются и лечебной практике как плазмозамещающее и кровоостанавливающее средство, а способность к гелеобразованию — при изготовлении капсул в фармацевтической практике.

Рис. 6. Схема гидратной оболочки вокруг белковой молекулы в присутствии HCl.

Факторы, влияющие на растворимость белков.

Растворимость разных белков колеблется в широких пределах. Она определяется их аминокислотным составом (полярные аминокислоты придают большую растворимость, чем неполярные), особенностями организации (глобулярные белки, как правило, лучше растворимы, чем фибриллярные) и свойствами растворителя. Например, растительные белки — проламины — растворяются в 60—80%-ном спирте, альбумины — в воде и в слабых растворах солей, а коллаген и кератины нерастворимы в большинстве растворителей.

Стабильность растворам белков придают заряд белковой молекулы и гидратная оболочка. Каждая макромолекула индивидуального белка имеет суммарный заряд одного знака, что препятствует их склеиванию в растворе и выпадению в осадок. Все, что способствует сохранению заряда и гидратной оболочки, облегчает растворимость белка и его устойчивость в растворе. Между зарядом белка (или числом полярных аминокислот в нем) и гидратацией существует тесная связь: чем больше полярных аминокислот в белке, тем больше связывается воды (в расчете на 1 г белка). Гидратная оболочка белка иногда достигает больших размеров, и гидратная вода может составлять до 1/5 его массы.

Правда, некоторые белки гидратируются сильнее, а растворяются хуже. Например, коллаген связывает воды больше, чем многие хорошо растворимые глобулярные белки, но не растворяется. Его растворимости мешают структурные особенности — поперечные связи между полипептидными цепями. Иногда разноименно заряженные группы белка образуют много ионных (солевых) связей внутри молекулы белка или между молекулами белков, что мешает Образованию связей между молекулами воды и заряженными группами белков. Наблюдается парадоксальное явление: в белке много анионных или катионных групп, а растворимость его в воде низкая. Межмолекулярные солевые мостики вызывают склеивание молекул белка и их выпадение в осадок.

Какие же факторы среды влияют на растворимость белков и их стабильность в растворах?

Влияние нейтральных солей.

Нейтральные соли в небольших концентрациях повышают растворимость даже тех белков, которые нерастворимы в чистой воде (например, эвглобулины). Это объясняется. тем, что ионы солей, взаимодействуя с противоположно заряженными группами молекул белков, разрушают солевые мостики между молекулами белков. Повышение концентрации солей (увеличение ионной силы раствора) оказывает обратное действие (см. ниже — высаливание).

Влияние рН среды.

рН среды влияет на заряд белка, а следовательно, на его растворимость. Наименее устойчив белок в изоэлектрическом состоянии, т. е. когда его суммарный заряд равен нулю. Снятие заряда позволяет молекулам белка легко сближаться, склеиваться и выпадать в осадок. Значит, растворимость и устойчивость белка будут минимальны при рН, соответствующем изоэлектрической точке белка.

Влияние температуры.

Строгой зависимости между температурой и характером растворимости белков не имеется. Одни белки (глобулины, пепсин, фосфорилаза мышц) в водных или солевых растворах с повышением температуры растворяются лучше; другие (альдолаза мышц, гемоглобин и т. д.) хуже.

Влияние разнозаряженного белка.

Если в раствор белка, являющегося полианионом (кислый белок), добавить белок, являющийся поликатионом (основной белок), то они образуют агрегаты. При этом устойчивость вследствие нейтрализации зарядов теряется, и белки выпадают в осадок. Иногда эту особенность используют для выделения нужного белка из смеси белков.

Высаливание.

Растворы нейтральных солей широко используются не только для повышения растворимости белка, например при выделении его из биологического материала, но и для избирательного осаждения разных белков, т. е. их фракционирования. Процесс осаждения белков нейтральными солевыми растворами называется высаливанием. Характерной особенностью белков, полученных высаливанием, является сохранение ими нативных биологических свойств после тудаления соли.

Механизм высаливания состоит в том, что добавляемые анионы и катионы солевого раствора снимают гидратную оболочку белков, являющуюся одним из факторов его устойчивости. Возможно, одновременно происходит и нейтрализация зарядов белка ионами соли, что также способствует осаждению белков.

Способность к высаливанию наиболее выражена у анионов солей. По силе высаливающего действия анионы и катионы располагаются в следующие ряды:

SO₄^2— > C₆H₅O₇^3— > CH₃COO^— > Cl^— > NO^3— > Br^— > I^— > CNS^—

Li⁺ > Na⁺ > K⁺ > Rb⁺ > Cs⁺

Эти ряды называются лиотропными.

Сильным высаливающим эффектом в этом ряду обладают сульфаты. На практике для высаливания белков чаще всего применяют сульфат натрия и аммония. Кроме солей белки осаждают органическими водоотнимающими средствами (этанол, ацетон, метанол и др.). Фактически это то же высаливание.

Высаливание широко используют для разделения и очистки белков, поскольку многие белки различаются по размеру гидратной оболочки и величине зарядов. Для каждого из них имеется своя зона высаливания, т. е. концентрация соли, позволяющая дегидратировать и осадить белок. После удаления высаливающего агента белок сохраняет все свои природные свойства и функции.

Денатурация белков.

Нативная конформация глобулярного белка исключительно лабильная и подвержена изменениям под влиянием химических агентов или энергетических и механических нагрузок. Под влиянием внешних факторов может происходить разрыв большого числа связей, стабилизирующих пространственную структуру белковой молекулы, упорядоченная уникальная для каждого белка конформация пептидной цепи нарушается, и белковая молекула целиком или большая ее часть принимает форму беспорядочного клубка — происходит его денатурация.

Денатурация белка — это внутримолекулярная перегруппировка его молекулы, не сопровождающаяся расщеплением пептидной связи. Аминокислотная последовательность белка не изменяется.

В результате денатурации происходит нарушение четвертичной, третичной и вторичной структур белка, образованных нековалентными связями, и биологическая активность белка утрачивается полностью или частично, обратимо или необратимо в зависимости от денатурирующих агентов, интенсивности и продолжительности их действия.

Денатурация вызывается высокими температурами — нагреванием раствора белка до 60. ..80 ⁰С, действием низких и высоких значений рН, интенсивным перемешиванием растворов белка или встряхиванием, а также действием поверхностно-активных веществ, обладающих полярными молекулами — мочевины (NH₂)₂CO? гуанидинхлорида [(NH₂)₂С = N⁺Н₂]С1^—, меркаптоэтанола НSСН₂СН₂ОН. Мочевина и гуанидинхлорид образуют новые ионные и водородные связи в белковой молекуле, меркаптоэтанол восстанавливает дисульфидные связи, соединяющие отдельные части пептидной цепи белка; разрушает ионные ассоциаты и ассоциаты неполярных частиц.

Кроме высоких температур из физических факторов денатурирующее действие на белковую молекулу оказывают высокое давление, излучения различной частоты и природы: a-, b-, g-излучения, токи высокой частоты, ультразвук и др.

Из химических факторов денатурацию белков вызывают соли тяжелых металлов — олова, меди, ртути, мышьяка, кадмия, свинца, марганца и др., нарушающие нативное распределение связей, стабилизирующих белковую молекулу.

Обработка белка денатурирующими агентами приводит к разворачиванию и в случае олигомерных белков к диссоциации олигомерного белка на протомеры. Механизм денатурирующего действия высоких температур и интенсивного встряхивания очевиден. Низкие рН превращают —СOO^---группы белка в

—СООН, а высокие –NН₃⁺ в —NН₂, поэтому ион-ионные взаимодействия в белковой молекуле нарушаются. Полярные денатурирующие агенты образуют новые для молекулы белка водородные и ионные связи с амино- и карбонильными группами пептидной цепи и некоторыми группами радикалов (R-групп) аминокислот, подменяя их собственные (нативные) внутримолекулярные связи в белковой молекуле. В результате вторичная и третичная структуры белка изменяются.

При денатурации кроме потерь биологической активности возникают потери или снижаются растворимость белка и его водопоглотительная способность, происходит изменение вязкости растворов белка, а также механических свойств белоксодержащих продуктов.

Денатурация белков имеет большое значение во многих технологических процессах пищевой промышленности — при выпечке хлеба, сушке макарон, овощей, зерна и семян, отжиме растительного масла на прессах, консервировании, кулинарной обработке пищевых продуктов и ряде других.

Под влиянием денатурации белки пищевых продуктов приобретают большую доступность действию протеолитических ферментов, возрастает реакционная способность химических групп, входящих в состав белковой молекулы, изменяется форма белковой молекулы — она разрыхляется или становится более компактной в зависимости от условий денатурации, гидрофобность белка растет.

При определенных условиях — медленном охлаждении раствора белка, денатурированного нагреванием, или удалении (например, диализом) из раствора белка полярных денатурирующих соединений — происходит ренатурация, или обратимая денатурация, — восстановление исходной (нативной) конформации белковой молекулы с восстановлением биохимической активности. Обратимая денатурация возможна также в зерне пшеницы, риса, ржи и других злаковых растений в период хранения в складе после тепловой сушки.

Процесс образования нативной структуры белковой молекулы — процесс самопроизвольный, так как эта структура отвечает минимуму свободной энергии молекулы.