Полимерные материалы для хроматографии и электрофореза.

Полимерные пористые тела и гидрогели в настоящее время широко используются в качестве стационарных фаз в хроматографии, электрохроматографии и электрофорезе для разделения смесей аминокислот, пептидов, нуклеиновых кислот.

Как аналитические, так и препаративные методики разделения таких смесей применяются в исследовательских лабораториях биохимического профиля, в медицине (многие виды клинических анализов), в криминалистике (генетический анализ, установление генетического родства и тп).

Электрофорез – это метод аналитического или препаративного разделения ионных соединений, основанный на различной подвижности молекул различных веществ в электрическом поле. Скорость, с которой заряженная молекула движется в электрическом поле в сторону соответствующего электрода, определяется вязкостью среды, размерами и формой молекулы, и величиной ее заряда (направление движения определяется знаком заряда). Молекулы большинства белков и пептидов, аминокислот, нуклеиновый кислот в водных растворах имеют некоторый электрический заряд; благодаря различию размеров молекул и величины заряда, эти вещества имеют различную электрофоретическую подвижность, что и позволяет проводить их разделение в электрическом поле. Различия в подвижности в большей степени проявляются в высоковязких средах, кроме того, высокая вязкость среды препятствует размыванию фронта движущихся аналитов за счет диффузии и броуновского движения. Поэтому для проведения электрофореза обычно используют гидрогели – студнеподобные системы с высоким содержанием воды, представляющие собой сильно набухшие сшитые полимеры, чьи макромолекулы образуют более или менее редкую сетку химических связей по всему объему образца. Молекулы растворителя (воды) и сравнительно небольшие молекулы анализируемых (разделяемых) веществ в такой системе могут двигаться относительно свободно под действием внешних полей – электрического, гидродинамического или их сочетания. Электрофорез предполагает движение только молекул аналита под действием электрического поля, в хроматографии молекулы аналита движутся вместе с потоком подвижной фазы под внешним давлением, а в электрохроматографии поток подвижной фазы поддерживается не внешним давлением, а электрическим полем.

В качестве неподвижной фазы для электрофореза используют, как правило гидрогель на основе полиакриламида, сшитого метилен-бис-акриламидом. Такой гидрогель может содержать до 99 объемных % воды. Выбор полимера для формирования гидрогеля обусловлен несколькими факторами – полимер должен быть гидрофильным (а гель иметь высокий коэффициент набухания), химически инертным, и по возможности, нетоксичным, недорогим и легко синтезируемым в лабораторных условиях. Полиакриламид удовлетворяет почти всем этим условиям, за исключением второго (постепенно гидролизуется в водных растворах, особенно щелочных). Акриламид полимеризуется по радикальному механизму в условиях вещественного или фотохимического инициирования. Как правило, реакция полимеризации протекает до 100% конверсии в течение 30-40 минут при комнатной температуре. Для вещественного инициирования применяют персульфаты калия или аммония в присутствии тетраметилэтилендиамина или 3-диметиламинопроионитрила (катализаторы распада персульфата при пониженных температурах), а для фотохимического инициирования применяют рибофлавин (витамин B2), который при облучении светом 445 нм эффективно генерирует свободные радикалы OH в результате обратимого окисления/восстановления в присутствии растворенного в воде кислорода.

Полиакриамидные гели для разделения пептидов, белков и олигонуклеотидов обычно готовятся непосредственно перед анализом прямо в электрофоретической ячейке. Раствор мономеров смешивают с раствором инициатора и заливают в форму. После завершения полимеризации наносят разделяемые вещества на стартовую позицию и проводят электрофоретическое разделение, после чего гелевую пластину разрезают на зоны и разделенные вещества извлекают экстракцией или электрофоретическим переносом.

Готовые смеси мономеров различного состава для гель-электрофореза коммерчески доступны как в сухом виде, так и в растворе.

Кроме полиакриламидных гелей, для электрофоретического анализа применяют также гели на основе агарозы. Такие гели используются для разделения нуклеиновых кислот. В данном случае процесс приготовления геля полностью аналогичен классическому приготовлению студня: агарозу растворяют в воде (буферном растворе) при нагревании, теплый раствор заливают в форму и охлаждают до застывания.

Как уже упоминалось, разделение анализируемых веществ в условиях гель-электрофореза обусловлено различной подвижностью заряженных молекул. Фактически, речь идет о перемещении молекул в пространственной сетке гидрогеля. Среди прочих факторов, скорость перемещения зависит от формы и размера молекулы и параметров пространственной сетки – ее густоты, размера ячейки, их взаимного расположения и распределения по размерам. Для эффективного разделения аналитов определенного типа необходимо использовать гель с подходящими параметрами пространственной сетки: слишком редкая сетка при небольших размерах молекул разделяемых веществ не даст хорошего результата – все молекулы одинаково быстро пройдут сквозь сетку гидрогеля. Аналогично, густо сшитые гели не годятся для разделения высокомолекулярных веществ – большие молекулы попросту «застрянут» в сетке гидрогеля. Строго говоря, решающее влияние имеет именно концентрация цепей полиакриламида (пространственная плотность их расположения), а не плотность сшивки (которая формально определяется как средняя длина фрагмента макромолекулы между двумя узлами сшивки и зависит от мольного соотношения мономер/сшиватель в реакционной смеси).

Плотность полимерной сетки гидрогеля для электрофореза регулируется концентрацией мономеров в полимеризуемой смеси (и полимера в получаемом геле). Соотношения акриламид/метилен-бис-акриламид обычно выдерживаются постоянными (используется коммерчески доступная готовая смесь).

В таблице приведен пример процентного содержание акриламида для разделения белков различной молекулярной массы.

Рецептуры для приготовления аналитических гелей могут быть достаточно сложны и включать в себя буферные растворы, поверхностно-активные вещества, катализаторы и др, а сам гель может формироваться в несколько этапов для создания градиента плотности геля по длине и высоте электрофоретической камеры.

В результате проведения полимеризации формируется гидрогель определенной плотности, в котором полиакриламидные цепи распределены в объема более или менее хаотично. В последнее время появились методики формирования пористых гидрогелей, в которых наряду с хаотической сеткой макромолекул полиакриламида существуют поры или система пор большего, чем предполагает концентрация мономеров, размера, более или менее регулярно расположенных в объеме геля. Такие гели предназначены для разделения совсем крупных молекул. Наибольший интерес представляют системы с цилиндрическими порами «тоннелями» строго определенного диаметра. В простейшем случае пористый гидрогель может быть получен путем замораживания во время полимеризации, так что система пор формируется из мельчайших кристалликов льда. Более «интеллектуальные» гидрогели получаются, если в качестве шаблона для формирования пористой структуры использовать мицеллы поверхностно-активных веществ. Как известно, дифильные молекулы в водной среде формируют агрегаты устойчивой формы – мицеллы, которые, в зависимости от условий (прежде всего, концентрации), принимают сферическую, цилиндрическую или пластинчатую форму. При высоких концентрациях цилиндры могут соединяться в сетчатые структуры, образуя двухфазно-непрерывные системы. Образование мицелл – процесс самопроизвольный и обратимый. Полимеризация акриламида в присутствии мицелл позволяет получить гидрогели с управляемой архитектурой системы пор. В этой области в настоящее время проводятся достаточно активные разработки.

Помимо гель-электрофореза на пластинах возможна реализация анализа на колонках или капиллярах многократного применения. Для формирования гидрогелей с определенными характеристиками широко используется сополимеризация большого числа функциональных мономеров. Мономеры акрилового ряда хорошо полимеризуются и сополимеризуются в водных растворах, что дает возможность широко варьировать свойства геля: кроме плотности геля и его жесткости (плотность сшивки), варьируются коэффициенты набухания, ионная проводимость, гидрофобность и т.д. В качестве сомономеров, кроме акриламида, широко используются – диметилакриламид, изопропилакриламид, N-винилпирролидон, водопоглощение и ионную проводимость увеличивают, используя акриловую кислоту или 2-акриламдо-2-метилпропан-1-сульфоновую кислоту и др.

До настоящего времени во всех видах колоночной хроматографии наиболее часто применялись «набивные» (заполненные) колонки, то есть колонки, неподвижная фаза (сорбент) вносится в которые в виде тонкодисперсных частиц (характеризуемых дисперсностью, пористостью, удельной поверхностью). В качестве таковых используются различные силикагели, окись алюминия, синтетические полимерные частицы, описанные выше. Альтернативным вариантом является заполнение колонки монолитной массой пористого полимера с определенными параметрами пористости. Такие сорбенты называют монолитными. Преимуществом такого сорбента является механическая стабильность системы пор (в отличие от набивных колонок, где частицы сорбента могут смещаться друг относительно друга).

Монолитные колонки требуют несколько иного подхода к их изготовлению. Если в случае набивной колонки синтез сорбента может быть осуществлен задолго до ее изготовления, то в случае монолитного сорбента эти два процесс неразрывно связаны. Сорбент формируется непосредственно в колонки и «пожизненно» фиксируется в ее объеме. Собственно, образец монолитного сорбента представляет собой пористый полимерный стержень, размерами в точности соответствующий внутренней полости колонки, более того, «приклеенный» к внутренним стенкам колонки, для того, чтобы не было «проскока» подвижной фазы между стенкой и слоем сорбента. Для приготовления монолитной колонки необходимо осуществить синтез монолитного сорбента непосредственно в ее объеме, так, чтобы неподвижная фаза сразу же оказалась «на своем месте». Таким образом, в колонку вводится смесь мономеров и проводится полимеризация, условия которой подбирают так, чтобы сформировалась пористая монолитная структура с совершенно определенными параметрами. Требования, предъявляемые к монолитным сорбентам (помимо индивидуальных аналитических целей), таковы:

- Протекаемость, то есть возможность существования непрерывного потока подвижной фазы с некоторой конечной интенсивностью.

- Механическая прочность, достаточная для сохранения основных характеристик в условиях рабочих давлений ВЭЖХ.

- Жесткость, достаточная для исключения эффектов набухания в различных подвижных фазах.

- Определенные значения общей пористости и среднего размера пор (подбирается под конкретную аналитическую задачу).

- Определенные значения полярности (также под задачу)

Для получения монолитных полимерных сорбентов в настоящее время используют органические, кремний-органические и неорганические полимеры. Процесс формирования сорбента представляет собой полимеризацию, сопровождаемую фазовым разделением, таким образом, из гомогенной смеси мономеров образуется гетерогенная (двухфазная) система полимер – низкомолекулярная жидкость. Реакционную смесь подбирают таки образом, чтобы исходные мономеры были полностью растворимы, но формирующийся полимер был бы несовместим с используемым растворителем, и процесс полимеризации приводил бы к образованию новой фазы. Отметим, что любые используемые для хроматографических целей полимеры являются нерастворимыми, поскольку представляют собой сильно сшитые системы (пространственные сетки). Однако нерастворимость не означает термодинамической несовместимости. Сшитые полимеры сильно набухают в подходящих растворителях, формируя псевдогомогенные гели, говорить о пористости которых в определенной степени бессмысленно. Для синтеза монолитного сорбента используются растворители, в которых набухания полимера не происходит, так что при полимеризации растворитель буквально «выдавливается» из полимера, образуя систему пор. Возможен, и даже более распространен и другой вариант – образующийся полимер выпадает из раствора в виде глобул, которые оказываются связаны друг с другом «проходными цепями» - макромолекулами, входящими одновременно в несколько глобул.

Конкретные рецепты реакционных смесей для синтеза монолитных сорбентов довольно сложны, и параметры получаемой пористой структуры очень чувствительны к их составу. Как правило, такие смеси содержат 2-3 типа мономеров (из них, как минимум один – полифункциональный), 2-3 растворителя и инициирующую систему. Среди органических полимеров наиболее часто используются производные полистирола и эфиров акриловой кислоты. В первом случае в смеси мономеров присутствуют стирол (основной мономер) и дивинилбензол (сшиватель), во втором бутилакрилат и этилен диметакрилат. Полимеризация осуществляется по радикальному механизму с вещественным инициированием, в качестве инициаторов используют динитрил азо-бис-изомасляной кислоты или перекись бензоила. Среди порообразующих расвторителей наиболее часто встречается смесь 1-пропанол – 1,4-бутандиол с содержанием последнего 20-25%, причем изменение количества бутандиола даже в указанных приделах может приводить к изменению среднего радиуса пор монолитного сорбента более чем вдвое. Использование органических полимеров, особенно акрилового ряда позволяет очень гибко регулировать свойства синтезируемого монолитного сорбента, такие как полярность, наличие ионизуемых групп, и даже настроить его на сорбцию совершенно определенных молекул. Полярность сорбента регулируется введением в реакционную смесь алкиловых эфиров акриловой или метакриловой кислоты (от метилового до октадецилового, который можно использовать в обращено-фазовой хроматографии), ионизуемые группы (необходимо для электрохроматографии) вводятся за счет использования ионных мономеров, таких как 2-акриламидо-2-метилпропансульфоновая кислота (анионные группы) или метакрилоилоксиэтил-триметлиамооний хлорид (катионные группы). Тщательным подбором условий полимеризации удается получить колноки для эффективного разделения аминокислот, пептидов, ароматических соединенй. Если проводить полимеризацию в присутствии молекул некоторого вещества А, которое затем удалить из колонки, в монолитном сорбенте останутся своего рода молекулярные отпечатки этого вещества, и в дальнейшем сорбент будет проявлять высокую селективность именно по отношению к А. При этом могут достоверно различаться например, 4- и 3- гидроксибензойные кислоты. Метод молекулярных отпечатков является одним из интересных, но достаточно сложных с точки зрения формирования рабочего тела – селективного сорбента, поскольку при его создании необходимо учитывать около 10 взаимовлияющих факторов.

Заключение.

Таким образом, современные методы синтеза полимеров в сочетании с определенной стратегией молекулярного дизайна позволяют получать полимерные материалы, обладающие широким набором функциональных свойств и рабочих характеристик, наиболее полно отвечающих требованиям для выполнения той или иной задачи от материалов для направленной доставки лекарственных препаратов до высокоселективных хроматографических сорбентов для анализа сложных биологических сред.