Спектры возбуждения и излучения флуоресценции; выход флуоресценции; поляризация.

Спектром излучения флуоресценции (спектром флуоресценции) называется зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны или частоты при постоянной интенсивности и длине волны возбуждающего света. Спектр флуоресценции описывается зависимостью Iизл=Iизл(λ) при Iв=const, λв=const (или νв=const). Длина волны возбуждающего света расположена в пределах спектра поглощения флуоресцирующего вещества; обычно она выбирается равной λmax, длине волны максимума спектра поглощения. Для регистрации спектра флуоресценции необходимы: источник возбуждающего света, два монохроматора (для возбуждения и для анализа спектра), фотоприемники для измерения интенсивности возбуждающего света и интенсивности флуоресценции.

Опытным путем установлено, что форма спектра флуоресценции (или нормированный спектр флуоресценции) не изменяется при изменении длины волны возбуждающего света в пределах полосы поглощения флуоресцирующего вещества. Это утверждение называется законом С.И. Вавилова. Он верен для одного поглощающего или излучающего вещества.

Спектр возбуждения флуоресценции определяет эффективность возбуждающего света разной длины волны в возбуждении флуоресценции. Спектр возбуждения определяется соотношением:

где F(λ) — зависимость интенсивности флуоресценции от длины волны, Ib(λ) — зависимость поглощенного возбуждающего света от длины волны. Обычно при измерениях спектра возбуждения интенсивность флуоресценции поддерживают постоянной, максимальной F(λ)=Fmax=const. Тогда спектр действия (возбуждения) флуоресценции выражается следующим образом:

Максимальную интенсивность флуоресценции поддерживают постоянной, изменяя интенсивность возбуждающего света. Тогда спектр возбуждения можно построить, откладывая величину, обратную интенсивности возбуждающего, против соответствующей длины волны.

Важной характеристикой является выход флуоресценции. Различают энергетический и квантовый выходы флуоресценции. Энергетическим выходом флуоресценции называется отношение интенсивности флуоресценции к интенсивности поглощенного света:

Квантовым выходом флуоресценции называется отношение числа испущенных квантов флуоресценции к общему числу поглощенных квантов.

Существуют флуоресцирующие вещества с очень большим квантовым выходом. Так, флуоресценция 6‑аминоакридина в спирте имеет квантовый выход около 0,9. Это значит, что очень мало поглощенной энергии переходит в тепло; по-видимому, в этом случае мы имеем дело с очень жесткой молекулой.

Весьма важной характеристикой флуоресценции является поляризация. В общем виде поляризация флуоресценции характеризует анизотропию излучающего осциллятора. Она может быть описана двумя величинами: поляризацией и анизотропией флуоресценции.

;

В этих формулах F║ и F┴ — интенсивности флуоресценции с компонентами параллельной и перпендикулярной поляризации возбуждающего света. Между P и A существуют следующие соотношения:

;

Для неподвижных и хаотически ориентированных молекул поляризация равна

В то же время при возбуждении неполяризованным светом

В этих формулах угол обозначает угол между поглощающим и излучающим диполями.