Пути биосинтеза вторичных метаболитов. Энзимология вторичного метаболизма.

Пути синтеза большинства вторичных метаболитов установлены достаточно хорошо. В настоящее время интенсивно изучается энзимология вторичного ме­таболизма. На основании имеющейся информации можно сформулировать не­которые закономерности биосинтеза этих соединений. Предшественниками синтеза служит относительно небольшое количество первичных метаболитов. Многие группы вторичных метаболитов могут синтезироваться несколькими путями. Часто этапы синтеза дублированы в разных компартментах клетки (на­пример, пластиды — цитозоль). Синтез четко спланирован и обслуживается набором специальных ферментов, в большинстве случаев весьма специфичных.

Биосинтез алкалоидов.Образование этих веществ тесно связано с общим обменом азота клетки. Для большинства алкалоидов показано, что схемы их синтеза унифицированы, т.е. имеют сходную последовательность реакций. Пред­шественниками синтеза протоалкалоидов и истинных алкалоидов являются аминокислоты. В процессе биосинтеза молекула аминокислоты практически полностью включается в структуру алка­лоида. Синтез алкалоидов разных групп включает одинаковые типы реакций: декарбоксилирование, окислительное дезаминирование, альдольная конденса­ция, но для каждой группы алкалоидов эти реакции осуществляют «собствен­ные» ферменты. На первом этапе синтеза происходит декарбоксилирование аминокислоты при участии соответствующей декарбоксилазы. Образовавшие­ся биогенные амины подвергаются окислительному дезаминированию с учас­тием аминооксидаз. Полученные в результате аминоальдегиды или аминокетоны в результате серии последовательных реакций образуют ключевые гетеро­циклические соединения. Затем происходит модификация базовой структуры с участием разнообразных реакций — гидроксилирования, метилирования и др. В формировании окончательной структуры алкалоида могут принимать участие дополнительные углеродные единицы, например ацетат (в виде ацетил-СоА) или монотерпеновая единица (для сложных индольных алкалоидов). В зависимости от сложности алкалоида его биосинтез включает от трех-четырех до десяти-пятнадцати реакций.

Для целого ряда алкалоидов не только установлена схема синтеза, но оха­рактеризованы и выделены ферменты. Оказалось, что некоторые ферменты синтеза не очень специфичны (в качестве субстратов могут использовать раз­личные соединения), однако в цепочке синтеза обязательно присутствуют высокоспецифичные ферменты, которые используют только один субстрат (или ряд очень близких субстратов) и выполняют очень специфичную реакцию. Например, при синтезе изохинолинов гидроксилирование базовой структуры по каждому положению выполняют разные ферменты. По мере продвижения к заключительным этапам синтеза сродство ферментов к субстрату обычно по­вышается: например, для ряда ферментов синтеза бербериновых алкалоидов К_т составляет менее 1 мкМ.

Биосинтез изопреноидов.Если при синтезе алкалоидов сходная цепочка пре­вращений используется для различных исходных соединений (аминокислот), то синтез колоссального числа изопреноидов происходит из единственного предшественника — изопентенилдифосфата (ИПДФ). Под действием фермента изопентенилдифосфатизомеразы, которая сдвигает двойную связь, ИПДФ превращается в диметилаллилдифосфат (ДМАДФ). Далее ИПДФ присоединя­ется к ДМАДФ по двойной связи и образуется С₁₀-соединение — геранилди-фосфат. Он служит источником всех монотерпеноидов. Затем к геранилди-фосфату присоединяется еще один ИПДФ и образуется С₁₅-соединение фарнезилдифосфат — исходное вещество для синтеза сесквитерпеноидов. Да­лее фарнезилдифосфат может либо присоединить еще одну молекулу ИПДФ с образованием геранилгеранилдифосфата (С₂₀-соединение — источник дитерпеноидов), либо димеризоваться с образованием сквалена (С₃₀-соединение — исходное соединение для всех тритерпеноидов). Наконец, геранилгеранилдифосфат может димеризоваться с образованием фитоина — С₄₀-соединения, источник тетратерпеноидов. Кроме того, к геранилгеранилдифосфату может последовательно присоединиться большое количество ИПДФ, формируя в конечном итоге полиизопреноиды — каучук и гуттаперчу. В результате описан­ных реакций образуется полный гомологический ряд С₅-соединений разной длины. Далее эти алифатические молекулы могут «свернуться» в циклические структуры, причем количество циклов, их размер и типы сочленения могут быть самыми разными.

Синтез базовых изопреноидных структур осуществляют всего два типа фер­ментов — пренилтрансферазы, которые «наращивают» длину изопренои­дов, и циклазы, которые формируют соответствующий циклический скелет молекулы. При этом каждый тип структуры формирует специфическая циклаза. Так как типов циклических структур изопреноидов довольно много, то и количество циклаз должно быть внушительным. К настоящему времени их из­вестно более ста. После формирования базовой структуры (или одновремен­но с этим), происходит ее модификация и «оснащение» функциональными группами.

Таким образом, биосинтез изопреноидов можно представить себе как свое­образный биохимический «моделист-конструктор». Вначале из унфицированых С₅-модулей изготовляются гибкие линейные конструкции разной длины. Они представляют собой практически идеальный материал для «биохимичес­кого конструирования» и формирования множества вариантов циклических структур.

Долгое время считалось, что во всех организмах исходное соединение для образования изопреноидов — ИПДФ — формируется единственным спосо­бом, а именно из мевалоновой кислоты, которая в свою очередь синтезирует­ся из трех молекул ацетил-СоА. Недавно было установлено, что разные орга­низмы используют различные способы синтеза ИПДФ. В клетках животных и грибов все изопреноиды синтезируются по «классическому» мевалонатному пути. Целый ряд микроорганизмов, в том числе многие цианобактерии и зеле­ные водоросли, используют другой вариант образования ИПДФ. В этом случае его предшественником является 1-дезоксиксилулозо-5-фосфат, который син­тезируется из пирувата и глицеральдегид-3-фосфата. Такой путь синтеза был назван «альтернативным», или «немевалонатным». Оказалось, что растения используют оба варианта образования изопреноидов: в цитозоле синтез идет по классическому пути, а в пластидах — по альтернативному. При этом возможно не только дублирование синтеза изопреноидов в разных ком-партментах клетки, но и разделение по типу синтезируемых структур. Тритерпеноиды (включая стероиды) синтезируются в цитозоле из мевалоната, тогда как дитерпеноиды (включая фитол хлорофилла) и тетратерпеноиды (прежде всего каротиноиды) — в пластидах по альтернативному пути. Моно- и сесквитерпены, вероятно, могут образовываться разными вариантами в зависимости от структуры молекулы и вида растения.

Биосинтез фенольных соединений. Кнастоящему времени известно два пути образования фенольных соединений — шикиматный (через шикимовую кисло­ту) и ацетатно-малонатный. Основной путь шикиматный, это практически единственный способ формирования ароматического кольца. В качестве исход­ных соединений для синтеза выступают фосфоенолпируват (ФЕП) и эритрозо-4-фосфат. При их конденсации возникает семиуглеродная кислота (2-кето-З-дезокси-7-фосфоарабогептановая), которая затем циклизуется в 5-дегидрохин-ную кислоту. Из дегидрохинной кислоты образуется шикимовая кислота, кото­рая имеет шестичленное кольцо, одну двойную связь, и ее легко перевести в соединения ароматического ряда. Из шикимовой кислоты возможно образова­ние оксибензойных кислот — л-оксибензойной, протокатеховой, галловой. Од­нако основной путь использования шикимовой кислоты — образование через префеновую кислоту ароматических аминокислот фенилаланина и тирозина. Фенилаланин (возможно, в ряде случаев и тирозин) — основной предшествен­ник синтеза фенольных соединений. Дезаминирование фенилаланина осуще­ствляет фермент фенилаланинаммиаклиаза (ФАЛ). В результате образуется ко­ричная кислота, гидроксилирование которой приводит к образованию пара-кумаровой (оксикоричной) кислоты. После дополнительного гидроксилиро-вания и последующего метилирования из нее образуются остальные оксико-ричные кислоты.

Оксикоричные кислоты представляют центральное звено синтеза всех фе­нольных соединений клетки. Ортокумаровая кислота является предшественником кумаринов. После ряда реакций укорочения алифатической части моле­кулы образуются С₆-С₂- и С₆-С₁-соединения — это второй путь образования оксибензойных кислот (первый — непосредственно из шикимовой кислоты). Оксикоричные кислоты могут образовывать различные конъюгаты, прежде всего с сахарами, однако основная масса оксикоричных кислот активируется путем взаимодействия с СоА. Два магистральных пути использования СоА-эфиров оксикоричных кислот — синтез лигнинов и синтез флавоноидов. Для синтеза лигнинов СоА-эфиры оксикоричных кислот восстанавливаются до спиртов, которые выступают в качестве мономеров синтеза. При синтезе флавоноидов СоА-производное оксикоричной кислоты взаимодействует с тремя молекула­ми малонил-СоА с образованием халкона. Реакцию катализирует фермент хал-консинтаза. Образовавшийся халкон легко преобразуется в флаванон. Из флаванонов за счет реакций гидроксилирования, окисления — восстановления об­разуются другие группы флавоноидов. Затем может происходить модификация молекулы — гликозилирование, метоксилирование и др.

Ацетатно-малонатный путь синтеза фенольных соединений широко распро­странен у грибов, лишайников и микроорганизмов. У растений он является минорным. При синтезе соединений по этому пути ацетил-СоА карбоксилиру-ется с образованием малонилацетил-СоА. Затем происходит каскад аналогич­ных реакций, в результате наращивается углеродная цепь и возникает поли-р-кетометиленовая цепочка. Циклизация поликетидной цепи приводит к образо­ванию различных фенольных соединений. Таким способом синтезируются фло-роглюцин и его производные, некоторые антрахиноны. В структуре флавонои­дов кольцо В формируется по шикиматному пути (из оксикоричной кислоты), тогда как кольцо А — по ацетатно-малонатному.

В клетке работают два шикиматных пути синтеза флавоноидов — один в пластидах, другой в цитозоле. В этих компартментах находится полный набор изоферментов шикиматного пути, а также ферментов фенольного метаболиз­ма, в том числе ФАЛ и халконсинтазы. Таким образом, в растительной клетке существует две параллельные цепочки синтеза фенольных соединений (анало­гично изопреноидам).

Синтез минорных классов вторичных соединений.Образование этих веществ также изучено достаточно полно. Для многих азотсодержащих соединений ис­ходными веществами являются аминокислоты. Например, синтез цианогенных гликозидов начинается с декарбоксилирования соответствующей амино­кислоты, затем последовательно формируются альдоксим, нитрил и α-гидроксинитрил. На последнем этапе синтеза образуется цианогенный гликозид за счет гликозилирования сх-гидроксинитрила при помощи УДФ-глюкозы. Син­тез обычно осуществляет комплекс ферментов: например, для дуррина этот комплекс состоит из четырех ферментов. Гены ферментов клонированы. Транс­генное по двум генам растение арабидопсиса приобрело способность к синтезу цианогенных гликозидов. Синтез беталаинов начинается от тирозина, который гидроксилируется и образуется диоксифенилаланин (ДОФА). ДОФА служит источником для двух фрагментов молекулы бетацианинов — беталамовой кис­лоты и цикло-ДОФА. Объединение этих двух соединений приводит к форми­рованию бетацианинов. При синтезе бетаксантинов беталамовая кислота кон­денсируется с пролином. Серосодержащие вторичные метаболиты обычно син­тезируются из серосодержащих аминокислот.

Изучение энзимологии вторичного метаболизма привело к открытию уди­вительно большого количества различных ферментов, участвующих в этом процессе.

Модификация вторичных метаболитов — источник их поразительного раз­нообразия. Модификация происходит прежде всего в реакциях замещения (их осуществляют ацилтрансферазы), метилирования, гликозилирования. В геноме арабидопсиса обнаружены гены 43 различных ацилтрансфераз. Несколько струк­турно близких ацилтрансфераз используют в качестве субстратов ацил-СоА, в их активном центре содержится консервативный гистидин. Гены ацилтрансфе­раз в геноме собраны в кластеры. Метилтрансферазы представляют собой су­персемейство ферментов, в которое входят О-, С-, N-, S-метилтрансферазы. Они используют в качестве метилирующего субстрата S-аденозинметионин (SAM) и осуществляют метилирование фенилпропаноидов, флавоноидов, алкалоидов, поликетидов, Сахаров. С-, N-, S-метилтрансферазы структурно (и, видимо, эволюционно) не связаны, тогда как О-метилтрансферазы имеют сходную первичную структуру и консервативный SAM-связывающий мотив. Гликозилирование осуществляют гликозилтрансферазы, причем существуют три типа ферментов: О-, С-, S-гликозилтрансферазы. Гликозилирование су­щественно изменяет свойства молекулы, прежде всего увеличивает ее раство­римость и снижает токсичность.

Окислительно-восстановительные превращения кардинально изменяют свой­ства молекулы. Эти реакции катализируют окислительно-восстановительные (редокс) ферменты вторичного метаболизма — «метаболические волшебные палочки». У растений обнаружили более 300 цитохром-Р₄₅₀-оксигеназ и более 100 диоксигеназ; при этом следует учесть, что диоксигеназы обычно мультисубстратны и образуют несколько продуктов.

ВТОРИЧНЫЙ МЕТАБОЛИЗМ РАСТЕНИЙ(6 часов)