Примеры некоторых рестриктаз и их рестрикционных сайтов

Типы рестриктаз Рестриктаза Сайт распознавания
Макрорестриктазы, распознающие последовательности из 6 и более нуклеотидов SmaI   5'...C C C^G G G...3' 3'...G G G^C C C...5'
SalI   5'...G^T C G A C...3' 3'...C A G C T^G...5'
XbaI 5'...T^C T A G A...3' 3'...A G A T C^T...5'
Стандартные рестриктазы HaeIII (BsuRI) 5'...G G^C C...3' 3'...C C^G G...5'

Примечание. ^ - место рестрикции.

II. Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот.

Молекулярная гибридизация -молекулярно-биологическая техника, основанная на способности одноцепочечной молекулы изучаемой ДНК/РНК специфически соединяться с комплементарными одноцепочечными зондами (молекулами-свидетелями) с образованием гибридных дуплексов, которые флюоресцируют или меняют цвет реакционной смеси.

Методы молекулярной гибридизации позволяют выявлять степень сходства двух молекул ДНК, что используется для эволюционного анализа, для идентификации и типирования микроорганизмов, а также для изучения экспрессии генов.

Варианты проведения молекулярной гибридизации.

1. В растворе.

2. В тканевых срезах (in situ). Тканевые срезы депарафинируют, демаскируют нуклеиновые кислоты в них и наносят гибридизационный раствор, содержащий специфические меченые зонды. Проводят денатурацию ДНК, гибридизацию, отмывку несвязавшихся зондов, после чего осуществляют детекцию гибридизировавшихся зондов по флюоресценции.

3. На микрочипах (эррей гибридизация) – наиболее совершенный метод. Позволяет наносить и фиксировать до нескольких сотен тысяч ДНК-зондов на поверхность стеклянного чипа, что дает возможность изучать одновременно все гены, присутствующие в ДНК микроорганизма.

4. На мембранах. Изучаемую ДНК фиксируют на мембранах и к ней добавляют гибридизационный раствор, содержащий специфические меченые зонды. В случае комплементарности зонд связывается с ДНК, после отмывки несвязавшихся зондов регистрируют флюоресценцию.

Этапы реакции гибридизации на мембранах:

А. Выделение ДНК. Методы аналогичны методам выделения ДНК для проведения ПЦР.

Б. Получение мелких фрагментов изучаемой ДНК(не более 5000 – 10000 п. о.). Для этого проводят либо рестрикцию (нарезку рестриктазами) крупной молекулы ДНК, либо ПЦР с образованием небольших ампликонов, либо обработку ультразвуком.

В. Нанесение ДНК на мембрану и фиксация ДНК на мембране:

– дот-блоты или слот-блоты.Перед нанесением ДНК денатурируют – превращают в одноцепочечные молекулы. Затем небольшие фрагменты изучаемой ДНК наносят на мембрану в виде точек (дот-блоты), либо полосок (слот-блоты).

– саузерн-блоты.Небольшие фрагменты изучаемой ДНК предварительно разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле. ДНК переносят из геля на поверхность мембран.

Перенесенную на мембрану ДНК фиксируют при 800С или УФ светом.

Г. Гибридизацияпроводится в несколько этапов:

– обработка предгибридизационным буфером мембраны с ДНК, что увеличивает связывающую способность мембраны;

– приготовление гибридизационного раствора, содержащего буфер и меченый зонд;

– программирование гибридизационной камеры и проведение гибридизации при 650С.

Д. Анализ результатов. Если зонд комплементарен одноцепочечному участку ДНК изучаемого микроорганизма, происходит связывание зонда и исследуемой ДНК. Некомплементарные несвязавшиеся зонды удаляют промыванием. В месте связывания зонда выявляют флюоресценцию или изменение цвета (рис. 30).

 

Рис. 30. Схема реакции молекулярной гибридизации для обнаружения в образцах ДНК возбудителя специфическим меченным зондом








Дата добавления: 2015-02-23; просмотров: 1348; ЗАКАЗАТЬ НАПИСАНИЕ РАБОТЫ


Поиск по сайту:

При помощи поиска вы сможете найти нужную вам информацию, введите в поисковое поле ключевые слова и изучайте нужную вам информацию.

Поделитесь с друзьями:

Если вам понравился данный ресурс вы можете рассказать о нем друзьям. Сделать это можно через соц. кнопки выше.
helpiks.org - Хелпикс.Орг - 2014-2019 год. Материал сайта представляется для ознакомительного и учебного использования. | Поддержка
Генерация страницы за: 0.004 сек.