Примеры некоторых рестриктаз и их рестрикционных сайтов

Примечание. ^ - место рестрикции.

II. Методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот.

Молекулярная гибридизация -молекулярно-биологическая техника, основанная на способности одноцепочечной молекулы изучаемой ДНК/РНК специфически соединяться с комплементарными одноцепочечными зондами (молекулами-свидетелями) с образованием гибридных дуплексов, которые флюоресцируют или меняют цвет реакционной смеси.

Методы молекулярной гибридизации позволяют выявлять степень сходства двух молекул ДНК, что используется для эволюционного анализа, для идентификации и типирования микроорганизмов, а также для изучения экспрессии генов.

Варианты проведения молекулярной гибридизации.

1. В растворе.

2. В тканевых срезах (in situ). Тканевые срезы депарафинируют, демаскируют нуклеиновые кислоты в них и наносят гибридизационный раствор, содержащий специфические меченые зонды. Проводят денатурацию ДНК, гибридизацию, отмывку несвязавшихся зондов, после чего осуществляют детекцию гибридизировавшихся зондов по флюоресценции.

3. На микрочипах (эррей гибридизация) – наиболее совершенный метод. Позволяет наносить и фиксировать до нескольких сотен тысяч ДНК-зондов на поверхность стеклянного чипа, что дает возможность изучать одновременно все гены, присутствующие в ДНК микроорганизма.

4. На мембранах. Изучаемую ДНК фиксируют на мембранах и к ней добавляют гибридизационный раствор, содержащий специфические меченые зонды. В случае комплементарности зонд связывается с ДНК, после отмывки несвязавшихся зондов регистрируют флюоресценцию.

Этапы реакции гибридизации на мембранах:

А. Выделение ДНК. Методы аналогичны методам выделения ДНК для проведения ПЦР.

Б. Получение мелких фрагментов изучаемой ДНК(не более 5000 – 10000 п. о.). Для этого проводят либо рестрикцию (нарезку рестриктазами) крупной молекулы ДНК, либо ПЦР с образованием небольших ампликонов, либо обработку ультразвуком.

В. Нанесение ДНК на мембрану и фиксация ДНК на мембране:

– дот-блоты или слот-блоты.Перед нанесением ДНК денатурируют – превращают в одноцепочечные молекулы. Затем небольшие фрагменты изучаемой ДНК наносят на мембрану в виде точек (дот-блоты), либо полосок (слот-блоты).

– саузерн-блоты.Небольшие фрагменты изучаемой ДНК предварительно разделяют электрофорезом в полиакриламидном геле. ДНК переносят из геля на поверхность мембран.

Перенесенную на мембрану ДНК фиксируют при 80⁰С или УФ светом.

Г. Гибридизацияпроводится в несколько этапов:

– обработка предгибридизационным буфером мембраны с ДНК, что увеличивает связывающую способность мембраны;

– приготовление гибридизационного раствора, содержащего буфер и меченый зонд;

– программирование гибридизационной камеры и проведение гибридизации при 65⁰С.

Д. Анализ результатов. Если зонд комплементарен одноцепочечному участку ДНК изучаемого микроорганизма, происходит связывание зонда и исследуемой ДНК. Некомплементарные несвязавшиеся зонды удаляют промыванием. В месте связывания зонда выявляют флюоресценцию или изменение цвета (рис. 30).

Рис. 30. Схема реакции молекулярной гибридизации для обнаружения в образцах ДНК возбудителя специфическим меченным зондом