ПРИНЦИПЫ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА

В конце 90-х годов XX века в диагностике инфекционных заболеваний ведущее место заняли молекулярно-генетические методы исследования,основанные на изучении биомолекул ДНК, РНК, белков в составе клеток (табл. 10). Они расширили представления:

– о структуре и регуляции функций живого;

– о происхождении микроорганизмов и их эволюции;

– о молекулярном патогенезе заболеваний;

– о возможности диагностики и лечения заболеваний.

Сферы использования молекулярно-генетических методов в микробиологии:

1. Диагностика инфекционных заболеваний. Маркёром возбудителя является его геном, а именно видоспецифические генетические участки, по которым определяют присутствие определенного вида микроорганизма в клиническом материале (идентифицируют микроорганизмы). Например, IS 6110 есть только у микобактерий туберкулеза, поэтому выявление IS 6110 дает прямое указание на присутствие возбудителя туберкулеза.

2. Химиотерапия и химиопрофилактика инфекционных заболеваний. Молекулярно-генетические методы широко используются для выявления маркеров резистентности - генов резистентности, либо мутаций в генах. Определение устойчивых к b-лактамным антибиотикам стафилококков проводят по наличию в их геноме гена mecA, энтеробактерий (E. coli и K. pneumoniae)и Pseudomonas aeruginosa – по генамtem, shv, oxa. Выявление резистентности к рифампицину у Mycobacterium tuberculosis проводят по мутациям в rpoB гене.

3. Санитарная микробиология. Молекулярно-генетические методы позволяют выявлять инфекционные агенты в пищевых продуктах, тем самым контролировать их качество, или расследовать причину пищевых отравлений. Эти методы позволяют определять генетически модифицированные пищевые продукты, а также проводить детекцию инфекционных агентов в окружающей среде.

4. Эпидемиология и инфекционный контроль.С помощью молекулярно-генетических методов определяют различия микроорганизмов одного вида (типируют микроорганизмы), выделенных от разных больных, в разных стационарах, в разных географических регионах. Это позволяет определять источники возбудителя, пути его распространения в стационаре, стране, мире и разрабатывать меры, контролирующие распространение эпидемических клонов.

5. Биотехнология, в том числе вакционология. С помощью молекулярно-генетических методов создают генетически модифицированные организмы с полезными для народного хозяйства свойствами. В последнее время в вакцинологии получил широкое распространение подход, называемый «обратной вакционологией». В классической вакцинологии основными объектами исследования являлись микроорганизмы-возбудители, которых инактивировали или лишали вирулентности, а затем микроорганизм или его компоненты использовали для вакцинации. В обратной вакцинологии основным объектом исследования является секвенированный геном микроорганизма, в котором с использованием компьютерного анализа проводят поиск генов (in silico анализ), кодирующих антигены микроорганизмов. Эти гены клонируют в геном E. coli или других неприхотливых микроорганизмов, которые начинают продуцировать «клонированные» белки, иммунногеные свойства которых изучают путем иммунизации мышей. Наиболее иммуногенные пептиды становятся кандидатами в вакцины и проходят дальнейшие клинические испытания. Такой подход использован для создания вакцин, в разработке которых с использованием классических методов испытывали сложности – против менингококков, стрептококков (Streptococcus pneumoniae), хламидий (Chlamydophila pneumoniae), стафилококков, иерсиний (Yersinia pestis), порфирормонад (Porphyromonas gingivalis), плазмодиев малярии (Plasmodium falciparum).

6. Систематика и эволюция микроорганизмов.Молекулярно-генетические методы позволяют создать естественную систематику микроорганизмов, отражающую их эволюционные взаимосвязи.

7. Геномика и патогеномика. При помощи молекулярно-генетических методов расшифровывают структуры и функций геномов, протеомов, внутриклеточных метаболитов, изучают молекулярный патогенез инфекционных заболеваний.

Материал для молекулярно-генетических исследований.Тип исследуемого материала зависит от симптомов, патогенеза, эпидемиологии предполагаемого заболевания.Для молекулярно-генетических исследований используется такой же материал, как и для бактериологического исследования:

– клинический биологический материал от больного (кровь, смывы, соскобы, слюна, гной, мокрота, спинномозговая жидкость, желудочный сок, отделяемое из уретры, моча, испражнения, биоптаты тканей и органов),

– пробы из объектов внешней среды (пищевые продукты, вода, почва),

– чистые культуры микроорганизмов.

Вид материала определяется методом, который будет использован для выделения ДНК/РНК.