Определение биохимических свойств микроорганизмов
| Фермент | Среда для детекции | Положительная реакция | ||
| САХАРОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ | ||||
| Амилаза | Крахмальный агар (агар с 0,2% крахмала) и раствор Люголя. | При нанесении раствора йода на среду с 18 - 24 часовой культурой микроорганизмов, вокруг колоний с амилазной активностью образуется светлый неокрашенный ореол, в то время как остальная среда приобретает сине-фиолетовый цвет из-за присутствия в ней крахмала. | ||
| Карбо-гидразы | Дифференциально-диагностические среды для энтеробактерий (Эндо, Левина, Плоскирева и др.); содержат лактозу, анилиновые красители. | Лактозопозитивные энтеробактерии (Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, K. pneumonia), образуют ярко окрашенные колонии, лактозонегнативные энтеробактерии (Salmonella, Shigella) – бледно-розовые или бесцветные колоний. | ||
| Полиуглеводные среды (Клиглера, Олькеницкого и др.). Среда Клиглера имеет малиново-красный цвет и содержит: 0,1% глюкозы, 1% лактозы, соли Fe 2+, феноловый красный (индикатор рН). | При разложении глюкозы желтеет столбик среды, при разложении лактозы желтеет скошенная часть среды, при разложении углеводов с образованием CO2 в среде также появляются газовые пузырьки или разрыв столбика; при образовании H2S наблюдается почернение по ходу укола. | |||
| Жидкие или полужидкие моноуглеводные среды Гисса; содержат один из углеводов, индикатор рН (табл. 5); рН среды устанавливают 7,2±0,2. Для выявления газообразования в жидкие среды вносят поплавок. | При разложении углеводов образуются кислые продукты, снижающие рН среды, в результате чего индикатор рН изменяет цвет. Газообразование на жидких средах приводит к накоплению газа в поплавке, в полужидких – появлению разрывов или газовых пузырьков в среде. | |||
| Продукция ацетил-метил-карбинола | Выявляют с помощью реакции Фогес-Проскауэра, используют 10% КОН или 20% КОН. | После добавления к культуре равного объёма 10% или 20% КОН и инкубации 4-24 часа при 370С в случае образования ацетилметилкарбинола среда окрашивается в розовый цвет с жёлтым оттенком; в случае образования ацетоина и 2,3-бутиленгликоля окраска не изменяется. | ||
| ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ | ||||
| Протеазы и пептидазы | 5% обезжиренное молоко. | Происходит свёртывание с образованием сгустков казеина и пептонизация с лизис казеина, при которой молоко становится прозрачным. Обе реакции могут происходить последовательно или одновременно. | ||
| Свёрнутая сыворотка. | Происходит разжижение. | |||
| Столбик желатина. | Происходит разжижение (желатину разжижают Proteus vulgaris, Bacillus anthracis). | |||
| Молочный агар в чашках Петри имеет мутно-белый цвет. | Появляются зоны просветления вокруг колоний на фоне мутно-белой среды. | |||
| Дезами-назы амино-кислот | Среда с одной из аминокислот и индикатором рН; рН среды 7,2±0,2. | Образуется аммиак, приводящий к защелачиванию среды и изменению цвета индикатора. | ||
| Декар-боксилазы | Среда с одной из основных аминокислот (аргинином, лизином, орнитином, гистидином, тирозином, глутамином) и индикатором рН. | При наличии декарбоксилазной активности среда подщелачивается за счёт образования диаминов, вызывая изменение цвета индикатора. | ||
| Трипто-фаназа | Мясо-пептонный бульон или среда с аминокислотой триптофаном, а также индикаторная бумажка, смоченная щавелевой кислотой и закреплённая под пробкой над питательной средой. | Образуется индол, который приводит к покраснению бумажки, смоченной щавелевой кислотой. | ||
| Десуль-фуразы (цисти-назы) | Среды с цистеином, метионином и качественным реактивом на H2S – солями железа, свинца, висмута. | Образуется H2S, который взаимодействует с Fe2+(Pb2+, Vi2+) с образованием сульфида железа черного цвета, что вызывает почернение среды. | ||
| Уреаза | Среда с мочевиной и индикатором рН - феноловым красным, рН среды устанавливают 6,8±0,2. | Образуется аммиак и окраска среды из красно-оранжевой переходит в малиново-лиловую за счёт сдвига рН в щелочную сторону. | ||
| ЛИПОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ | ||||
| Липаза | Желточный агар или среда с твином-80. | Липазы гидролизуют жиры на глицерин и свободные жирные кислоты. Вокруг колоний в проходящем свете на поверхности среды видна радужная пленка (похожа на бензиновую пленку на поверхности воды). | ||
| Лецити-наза | Желточный агар (к 300 мл стерильного МПА, расплавленного и охлажденного до 45-500С, добавляют источник лецитина - желток куриного яйца). | Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфохолин и диглицерид, и вокруг колоний появляются опалесцирующие зоны, или «венчики помутнения»; лецитиназа есть у Staphylococcus aureus, клостридий, фузобактерий. | ||
| ОКИСЛИТЕЛЬНО-ВОССТАНОВИТЕЛЬНЫЕ ФЕРМЕНТЫ (ОВФ) | ||||
| Оксидаза | Фильтровальная бумага, смоченная свежеприготовленным 1% раствором тетраметилпарафенилен-диамина (реактив на оксидазу). | При нанесении бакпетлей 18-24 часовой культуры на поверхность фильтровальной бумаги в течение 1 мин появляется пурпурно-фиолетовое окрашивание; используют для дифференциации Pseudomonas spр. (оксидазопозитивные) и энтеробактерий (оксидазонегативные). | ||
| Каталаза | 3% раствор Н2О2; присутствие каталазы определяют у микроорганизмов, выращенных на любой питательной среде, кроме кровяных сред. | При нанесении на колонию перекиси водорода, либо при внесении культуры в каплю перекиси на предметном стекле появляются пузырьки газа; используют для дифференциации Streptococcus spр. (каталазопозитивные) и Staphylococcus spp. (каталазонегативные). | ||
| Дегид-разы | Сахарный полужидкий агар (донор водорода) с 1% метиленовым синим (акцептор водорода). | Дегидразы способны восстанавливать некоторые органические красители, поэтому метиленовый синий обесцвечивается. Используют для определения бактериальной обсеменённости молока: подкрасив молоко метиленовой синькой, определяют время его обесцвечивания. Чем оно меньше, тем более обсеменено молоко. Качественное молоко долго остаётся синим. | ||
| Перокси-даза | Используют бензидиновый тест: на предметное стекло наносят 4-6 капель суточной бактериальной культуры добавляют по 1-3 капли 2 % раствора метилпарааминофенол сульфата и 3% раствора Н2О2. | В течение 5 – 10 мин бесцветная среда приобретает розовую или вишнёво-красную окраску. Положительная реакция характерна для Staphylococcus spp., отрицательная - Pseudomonas spp., Escherichia spp. | ||
| ФЕМЕНТЫ-ТОКСИНЫ | ||||
| Гемо-лизины | 5-10% кровяной агар. | a-гемолизины приводят к неполному гемолизу с образованием вокруг колоний зоны неполного просветления среды, которая в течение 2-5 суток приобретает зеленовато-бурый оттенок. b-гемолизины вызывают полный гемолиз с образованием прозрачной зоны вокруг колоний. g-гемолизины не дают видимого глазом гемолиза. | ||
| О-стрепто-лизин | В пробирки с двукратными разведениями b-гемолитических стрептококков добавляют равный объем 5% эритроцитов кролика, инкубируют при 370С 1 час; параллельно ставят контроль из взвеси эритроцитов в питательном бульоне. | В положительных случаях происходит гемолиз (лаковая кровь), в отрицательных случаях образуется осадок из эритроцитов. Определяют титр О-стрептолизина - наибольшее разведение микробной культуры при котором наблюдается гемолиз. | ||
| Плазмо-коагулаза | Стерильная цитратная плазма крови, разлитая по 0,4 мл в пробирки. | После внесения суточной агаровой культуры и инкубации посевов 2-5 часов при 370С происходит свёртывание плазмы и утрата ею текучести. | ||
| Гиалуро-нидаза | Побирка с гиалуроновой кислотой и уксусная кислота; при добавлении к гиалуроновой кислоте уксусной кислоты образуется сгусток муцина. | Если тест-культура образует гиалуронидазу, то после 15 мин инкубации культуры бактерий при 370С в пробирке с гиалуроновой кислотой и добавления 2-3 капель уксусной кислоты образуется сгусток муцина. | ||
| Нуклеазы | МПА с ДНК, среда опалесцирует (полупрозрачна). | Через 18-24 часа культивирования на среде после нанесения на ее поверхность 0,1% H2SO4 из-за деполимеризации ДНК и РНК вокруг колоний образуется прозрачный ореол - «венчик просветления». | ||
| Фибри- нолизин | Сгустки фибрина. | Растворение сгустков фибрина. | ||
| Цито-токсины | Культура эпителиальных клеток или др. и токсин, выделенный путем фильтрования культуральной жидкости с использованием бактериальных фильтров. | При культивировании культуры клеток с безмикробным фильтратом токсина культура клеток утрачивает типичную тканевую морфологию: округляется, ядра пикнотизируются. | ||
| Летучие жирные кислоты | Газо-жидкостная хроматография кислото-эфирного экстракта ЛЖК из биологического материала или культуральной жидкости, содержащей анаэробы. | На хроматограмме появляются пики в зависимости от массы и полярности вещества: чем легче вещество, тем раньше появляется пик на хроматограмме, поэтому ЛЖК выходят в следующей последовательности: уксусная, пропионовая, масляная, валериановая, капроновая (рис. 25). Изомасляная, изовалериановая, изокапроновая кислоты выходят раньше соответствующей кислоты. | ||
 Рис. 25.Хроматограмма выхода ЛЖК, отражающая зависимость времени выхода стандартного раствора смеси летучих жирных кислот от их молекулярной массы и полярности (чувствительность электрометра 1 10 – 9)
|
В последние годы в бактериологических лабораториях применяются одноразовые коммерческие тест-системы для биохимической идентификации. Они представляют собой пластиковые планшеты с лунками, заполненными дегидратированными субстратами с индикатором рН. Тест-системы позволяют изучать 20, 32, 64 биохимических признака (рис. 26).
Схема идентификации с использованием таких тест-систем включает следующие этапы:
1) выделение чистой культуры или изолированных колоний на плотной питательной среде;
2) приготовление бактериальной суспензии с определенной концентрацией микроорганизмов, которую определяют путем сравнения со стандартами мутности;
3) 
внесение суспензии микроорганизмов в лунки тест-системы;
4) инкубация в термостате от 4 до 24 часов (длительность зависит от тест-системы) при 370С;
5) учёт результатов, который может быть:
а) визуальным по изменению цвета индикатора;
б) автоматическим с использованием микробиологического анализатора.
6) анализ результатов с использованием компьютерного банка данных, включающего биохимические профили разных видов микроорганизмов. Результаты ферментации учитываются по принципу +/- и вносятся в референс-таблицу, после чего происходит сравнение с компьютерным банком данных. Идентифицируемый микроорганизм относят к тому виду, с которым он проявляет наибольшее сходство и указывают степень сходства (в %). Хорошей идентификацией считается идентификация с 95% (и более) совпадением признаков.
Дата добавления: 2015-02-23; просмотров: 2373;