III. Методы, основанные на амплификации нуклеиновых кислот.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была разработана в 1983 г. американским биохимиком Кэри Мюллисом, который в 1993 г. был удостоен за это открытие Нобелевской премии.

Метод ПЦР основан на принципе естественной репликации ДНК и заключается в получении множественных копий (ампликонов) ДНК размером до 5000 п. о.

В качестве амплифицируемых участков ДНК микроорганизмов могут выступать гены патогенности, жизненно важных функций (гены «домашнего хозяйства»), устойчивости к противомикробным препаратам, видо- и родоспецифичные гены (важны для идентификации).

Принцип ПЦР. После температурной денатурации двухцепочечной ДНК образуются одноцепочечные молекулы, к которым присоединяются небольшие олигонуклеотиды – праймеры. Праймеры присоединяются только к комплементарному участку ДНК на обоих цепях ДНК и ограничивают амплифицируемый фрагмент с двух сторон. К 3’концу праймера прикрепляется ДНК-полимераза и на ДНК-матрице синтезирует копию. Синтез ДНК протекает только между праймерами.

Каждая стадия происходит при определенной температуре (рис. 31).

Рис. 31. Схема полимеразной цепной реакции

Каждый вновь синтезируемый фрагмент ДНК служит матрицей для синтеза двух новых нитей в следующем цикле амплификации. При многократном (30-40 раз) повторении этих стадий и оптимальном сочетании компонентов реакционной смеси происходит экспоненциальное увеличение количества ампликонов до 2ⁿ, где n - число циклов амплификации. Детекцию образуемых ампликонов проводят с использованием электрофореза, либо флюоресцирующих зондов, либо флюоресцирующего ДНК-красителя SybrGreen. Получающиеся ампликоны имеют определенный размер, равный количеству олигонуклеотидных пар амплифицируемой последовательности и праймера.

Постановка ПЦРпроводится в 5 этапов.

1этап. Выделение (экстракция) ДНК из клеток(рис.32).Метод выделения ДНК зависит от изучаемого микроорганизма и вида материала для исследований.

На этой стадии клетки лизируют одним из способов: а) ферментативно (лизоцим); б) химически; в) термически (90 – 95⁰С). Клеточный дебрис осаждают центрифугированием, при этом ДНК остается в растворе. В некоторых случаях возникает необходимость в концентрировании ДНК. Для этого находящуюся в растворе ДНК адсорбируют на сорбенте, а затем проводят десорбцию ДНК небольшим количеством элюента. Концентрируют ДНК также с использованием осаждающих ДНК веществ, после чего осевшую ДНК ресуспендируют в небольшом объеме воды.

2 этап. Приготовление реакционной смеси. В микроцентрифужных пробирках объемом 0,5 или 0,2 мл смешивают компоненты реакционной смеси так, чтобы объем общей реакционной смеси составлял 25, 50 или 100 мкл. Все компоненты реакции вносят микропипеткой, причём каждый раз наконечник микропипетки меняют во избежание контаминации.

Обязательные компоненты реакционной смеси:

а) раствор искомой ДНК, выделенной на предыдущей стадии;

б) смесь четырёх дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфатов) - строительный материал ДНК;

в) термостабильная ДНК-полимераза - Taq-полимераза (не денатурирует при 96⁰С), осуществляющая полимеризацию нуклеотидов; ее получают из

термофильных микроорганизмов Termophilus aquaticus;

г) два синтетических праймера (прямой и обратный) - короткие, длиной 15 - 30 оснований, одноцепочечные олигонуклеотиды, которые связываются с комплементарными структурами исследуемой ДНК и с которых начинается биосинтез множественных копий;

д) специфический буфер. Для функционирования Taq-полимеразы необходимы ионы Mg⁺², определённые значение рН и концентрации солей.

Необязательным компонентом являются присадки, увеличивающие специфичность реакции.

3. Программирование температурного цикла и проведение амплификации заданного фрагмента ДНК в термоциклере (рис.33). На выделенной ДНК-матрице происходит процесс многократного копирования ДНК в ходе последовательно сменяющихся циклов. Пробирки с реакционной смесью размещают в приборе - термоциклере. Температурные режимы циклов в термоциклере изменяются в соответствии с заданной программой. Программа проведения ПЦР включает 4 стадии (табл. 13).

Таблица 13