Работа 5. Обнаружение дегидрогеназ при спиртовом брожении

В нормальных условиях спиртового брожения образовавшийся в процессе декарбоксилирования пировиноградной кислоты уксусный альдегид

пируватдекарбоксилаза

СН₃-СО-СООН СН₃СОН + СО₂

восстанавливается с помощью фермента алкогольдегидрогеназы и ее кофермента НАД·Н₂ в спирт этанол:

алкогольдегидрогеназа

СН₃СОН + НАД·Н₂ СН₃СН₂ОН + НАД

Если ввести второй акцептор водорода, например, метиленовую синь, то последняя, присоединяя водород, будет переходить в лейкосоединение и раствор обесцветится.

ХОД РАБОТЫ

Убедиться в наличии дегидрогеназ при спиртовом брожении можно следующим образом. В колбу емкостью 100 мл внести 2 г прессованных дрожжей, прилить 20-30 мл 3%-ного сахара и хорошо взболтать. Затем прилить еще 40-50 мл раствора и снова взболтать. Взять 2 пробирки. Одну из них заполнить почти доверху раствором с дрожжами. Оставшийся раствор в колбе перекипятить в течение 3 минут, остудить и налить во вторую пробирку (контрольную). В обе пробирки внести 3-5 капель раствора метиленовой сини и закрыть ватными пробками. Поместить в водяную баню с температурой около 35°С.

Восстановление метиленовой сини в опытной пробирке начинается через несколько минут и вскоре раствор полностью обесцвечивается (20-25 минут). Раствор в контроле остается без изменения. Если, вынув ватную пробку из опытной пробирки, хорошо взболтать раствор либо продуть воздухом, то синяя окраска снова возвращается вследствие окисления кислородом воздуха образовавшегося лейкосоединения.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) колбы на 50 мл; 2) 3%-ный раствор сахара; 3) прессованные или сухие дрожжи; 4) водяная баня; 5) пробирки; 6) спиртовка; 7) метиленовая синь; 8) ватные пробки.

Работа 6. Метод определения активности дегидрогеназ с помощью вакуум-инфильтрации (по Пыльневу)

В основу метода положена способность дегидрогеназ восстанавливать бесцветные соли тетразолия с образованием окрашенного формазана. Бесцветный ТТХ - 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид, присоединяя водород, восстанавливается до формазана красного цвета. Формазан нерастворим в воде, но хорошо растворяется в ацетоне или изопропиловом спирте. Метод позволяет работать с малыми навесками материала и выявлять активность дегидрогеназ как бесцветных (что удобнее), так и окрашенных пигментами биологических тканях.

ХОД РАБОТЫ

При работе нужно выбирать однородный материал и разрезать крупные объекты на пластинки толщиной 1,5-2 мм. В маленькие бюксы берут навески по 30-100 мг предварительно разрезанного на пластинки растительного материала. Для навески заливают 5 мл раствора 2,3,5-трифенилтетразолия, приготовленного на буферной смеси; третью (контрольную) погружают в 5 мл чистой буферной смеси. Исследуемый материал сверху придавливают небольшим грузом (стеклянной пробкой) и помещают в вакуум-эксикатор, из которого масляным насосом выкачивают воздух, под давлением которого раствор начинает проникать в ткани. Бюксы закрывают крышками и переносят на 30 минут в термостат с температурой 31°С, где ткани приобретают красный цвет, интенсивность которого зависит от активности дегидрогеназ.

Затем каждую пробу вынимают из бюкса и тщательно растирают в ступке с небольшим количеством ацетона или изопропилового спирта. Содержимое ступки переносят в мерный цилиндр и доводят до 5-10 мл, в зависимости от интенсивности окраски. Остатки измельченной ткани должны полностью обесцветиться. После растирания все пробы центрифугируют в течение 3 минут при 1 500 оборотов в минуту и полученный окрашенный формазаном экстракт сразу колориметрируют на ФЭК при синем светофильтре. Если контрольная вытяжка зеленая, то чтобы снять цвет хлорофилла, колориметрируют при зеленом светофильтре. Активность дегидрогеназ вычисляют по разнице оптической плотности между показаниями ФЭК в опытных и контрольных пробах. Эта разница, выраженная в целых числах, названа индексом активности дегидрогеназ.

Результаты опыта записывают по следующей схеме:

Все три выполняемые в практикуме работы (4, 5, 6) служат ярким подтверждением теории В.И. Палладина об активации водорода (отщеплении от дыхательного субстрата) в анаэробной стадии дыхания.

МАТЕРИАЛ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) проростки злаковых, клубни картофеля или другой растительный материал; 2) 1/15 М буферная смесь Серенсена III с рН 7,17; 3) 2,3,5-трифенилтетразолий хлористый, 0,25-0,5%-ный раствор, приготовленный на буферной смеси Серенсена III; 4) 85%-ный ацетон или изопропиловый спирт; 5) бюксы; 6) мерные цилиндры на 10 мл; 7) лезвия безопасной бритвы; 8) фарфоровые ступки; 9) весы торзионные или аналитические; 10) вакуум-эксикаторы; 11) насос Камовского; 12) термостат; 13) центрифуга; 14) ФЭК.

ПРИМЕЧАНИЕ. Для приготовления 1/15 М буферной смеси Серенсена с рН 7,17 в 100 мл дистиллированной воды растворяют 0,831г Na₂НРО₄× 2Н₂О и 0,272 г КН₂РО₄.