Работа 3. Окислительные ферменты дыхания

Из многих окислительно-восстановительных ферментов, вырабатываемых растениями, в данной работе исследуются только два:

1. Полифенолоксидаза - фермент, повышающий окислительный потенциал молекулярного кислорода, соединяя его с водородом, отщепляемым от полифенолов по схеме:

дифенол хинон

2. Пероксидаза - фермент, активизирующий кислород воздуха, окисляющий полифенолы и ароматические амины кислородом в присутствии перекиси водорода, например:

дифенол + Н₂О₂ → хинон + 2Н₂О

Обнаружить эти ферменты можно при помощи раствора гваяколовой смолы, которая при окислении активированным (атомарным) кислородом меняет свою окраску из коричневой в синюю. Работу удобно проводить на двух срезах исследуемой части растений, нанося на первый срез раствор гваяколовой смолы, а на второй - раствор гваяколовой смолы и перекись водорода. Посинение первого среза свидетельствует о присутствии в клетках полифенолоксидазы, тогда как посинение второго среза есть результат совместного действия двух ферментов: полифенолоксидазы и пероксидазы или в случае отсутствия в данном объекте первого фермента - одной пероксидазы.

ХОД РАБОТЫ

Поместить на тарелку 2 куска исследуемого объекта и облить оба куска одновременно раствором гваяколовой смолы, причем второй срез дополнительно обработать каплей раствора перекиси водорода. Для контроля обработать таким же образом материал, предварительно подвергнутый кипячению. Исследовать несколько объектов, не допуская при этом попадания сока из одного объекта на срез другого.

Результаты занести в таблицу:

Можно ингибировать полифенолоксидазу хлоридами, посыпав поверх среза клубня NaCl или BaCl, KCl, CaCl и т.д. Пероксидаза хлоридами ингибируется в меньшей степени, поэтому при добавлении перекиси водорода на срез, где была нанесена соль и добавлена гваяколовая смола, посинение все же происходит, хотя и менее интенсивно.

В целом данная работа подтверждает теорию А.Н. Баха об активации ферментами-оксидазами О₂ воздуха в заключительной стадии дыхания.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) клубни картофеля, корнеплоды редьки, корни хрена и др.; 2) 1%-ный спиртовой раствор гваяколовой смолы; 3) 3%-ный раствор перекиси водорода; 4) тарелки; 5) скальпель.