Работа 8. Подача с пасокой аминокислот и амидов, синтезированных корневой системой из поглощенных неорганических соединений азота

Очень важно и то, что корневая система не только орган поглощения воды и минеральных веществ, но и орган первичного синтеза многих органических соединений. При поглощении из наружной среды минеральных соединений азота (ионов NH⁴⁺ и NO^3-) часть их подается в надземные органы в неизменном виде, но, как впервые доказано Д.А. Сабининым, большая часть минеральных соединений азота уже в тканях корня превращается в органические соединения: аминокислоты, амиды, белки. Аминокислоты и амиды подаются в надземные органы, что можно обнаружить, анализируя пасоку растений.

Для работы используют метод определения в растворах суммарной концентрации всех аминокислот и амидов (метод Н.А. Бояркина). Метод основан на сравнении интенсивности окрашивания пятен, полученных на фильтровальной бумаге после реакции с нингидрином стандартных растворов аминокислот и испытуемой пасоки содержащей то или иное количество азотистых соединений. Нингидрин реагирует с большинством α-кислот, дезаминируя и декарбоксилируя их. В результате реакции образуются окрашенные продукты, цвет которых колеблется от сине-фиолетового до розово-фиолетового. Интенсивность окрашивания пропорциональна концентрации аминокислот.

В качестве стандартных используют два раствора: аланин и глютаминовую кислоту. Аланин дает с нингидрином сине-фиолетовое окрашивание, а глютаминовая кислота - розово-фиолетовое.

ХОД РАБОТЫ

1. У 10-15-дневных проростков кукурузы, тыквы или других растений, выращенных на питательной смеси Кнопа, срезают надземные органы. Через короткий промежуток времени на поверхности стебля из порезанных сосудов ксилемы появляются капли пасоки. Алюминиевой петлей их переносят на полоски хроматографической бумаги. Можно на пенек плотно надеть стеклянный капилляр, в него поднимется пасока.

2. Приготавливают: а) 0,5%-ный раствор нингидрина в 96%-ном этаноле; б) серию растворов аланина и глютаминовой кислоты с равным содержанием аминогрупп.

Концентрации растворов следующие:

глютаминовая кислота: 10 5 2,5 1,25 мг/мл

аланин: 6,4 3,2 1,6 0,8 мг/мл

3. Из хроматографической бумаги нарезают полоски размером 8×1,5 см. На трех полосках бумаги ставят обычным карандашом 4 точки на расстоянии 1 см друг от друга. Алюминиевой петлей (d=2 мм) наносят на одну полоску растворы глютаминовой кислоты, на вторую - аланина (разных концентраций), на третью - четыре капли паcоки (паcоку предварительно из капилляра переносят в часовое стекло). Высушивают полоски на воздухе, после чего при помощи ватной кисточки быстрым движением пропитывают их раствором нингидрина. Снова высушивают их на воздухе. Кладут полоски бумаги между двумя стеклами, нагретыми до 40-60°С, и оставляют при этой температуре 3-10 минут. Все операции для полосок с пасокой и для полосок со стандартными растворами должны быть строго одинаковыми.

Сравнение интенсивности окрашивания пятен пасоки с интенсивностью окрашивания пятен стандартных растворов позволяет сделать заключение о суммарной концентрации аминокислот и амидов в пасоке. Пятна сравнивают с пятнами раствора аланина и глютаминовой кислоты в зависимости от оттенка окраски пятен пасоки. Концентрацию аминокислот в пасоке выражают в мг/мл и в мг азота аминогрупп/мл.

МАТЕРИАЛЫ И ОБОРУДОВАНИЕ

1) 10-15-дневные проростки кукурузы или других растений; 2) питательная смесь Кнопа; 3) хроматографическая бумага; 4) алюминиевая петля; 5) часовые стекла; 6) 0,5%-ный раствор нингидрина на 96%-ном этаноле; 7) аланин; 8) глютаминовая кислота; 9) стеклянные капилляры.