Определение активности амилаз по Вольгемуту

Метод основан на нахождении максимального разведения жидкости, содержащей амилазу (вытяжка из солода, слюна, молоко, сыворотка крови и др.), при котором в стандартных условиях происходит полное расщепление определенного количества крахмала.

ХОД РАБОТЫ. В штатив устанавливают и нумеруют 7 пробирок и в каждую вносят по 1 мл воды. Затем в первую пробирку добавляют 1 мл вытяжки из солода, тщательно перемешивают и 1 мл смеси из пробирки 1 переносят в пробирку 2. Содержимое тщательно перемешивают и 1 мл смеси из пробирки 2 переносят в пробирку 3 и т.д. Из последней пробирки 1 мл смеси после перемешивания выливают. Таким образом, получается ряд разведений, в котором содержание солодовой вытяжки в каждой следующей пробирке в 2 раза меньше, чем в предыдущей.

После этого в каждую пробирку вносят по 2 мл раствора с массовой долей крахмала 1 % и содержимое перемешивают встряхиванием. Все пробирки помещают в термостат при 37-38 °С на 30 мин. По окончании инкубации в каждую пробирку добавляют по 1 мл раствора с массовой долей серной кислоты 10 % (для остановки реакции) и по 3 капли водного раствора йода. Результат опыта вносят в табл. 16, обозначая окраску первыми буквами образовавшегося цвета раствора.

Таблица 16

Окраска проб с йодом после инкубации

Отмечают, в каких пробирках произошел полный гидролиз крахмала (желтое окрашивание с йодом) и по последней из них рассчитывают активность амилазы (амилазное число). Допустим, полный гидролиз взятого для опыта крахмала произошел в 1, 2, 3 и 4 пробирках, следовательно, активность амилазы нужно считать по пробирке 4, в которой доля солодовой вытяжки составляет 1/16 мл. Пересчитав объем расщепленного крахмала на 1 мл солодовой вытяжки, получим число 32. Это означает, что 1 мл неразбавленной солодовой вытяжки в таких же условиях может расщепить 32 мл раствора с массовой долей крахмала 1 %, т.е. амилазное число составляет 32.

При определении амилазной активности молока кратность разведения уменьшают в 8-10 раз, время инкубации увеличивают до 60 мин, для исследования применяют раствор с массовой долей крахмала 0,1 %.

РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; водная вытяжка из солода; растворы с массовыми долями: крахмала 1 % (суспендируют 1 г растворимого крахмала в 10 мл холодной воды, затем при помешивании добавляют 90 мл кипящей воды и кипятят 1 мин, охлаждают, доливают водой до 100 мл и перемешивают), серной кислоты 10 % (60,6 мл концентрированной серной кислоты влить в 0,5 л воды и разбавить в мерной колбе до 1 л) или соляной кислоты 10 % (236 мл концентрированной соляной кислоты влить в 0,5 л воды и разбавить в мерной колбе до 1 л); водный раствор йода.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.

1. Принцип метода определения активности амилазы по Вольгемуту?

2. Техника получения разведений раствора амилаз.

3. Как определить максимальное разбавление амилазы, осуществившей полный гидролиз крахмала?

4. Расчет активности амилазы по Вольгемуту.