Факторы, влияющие на скорость ферментативных реакций (на активность ферментов)

Белковая природа обеспечивает ферментам характерные для белков строение и свойства и, прежде всего, лабильность, т.е. способность изменять активность в зависимости от различных факторов (температуры, рН, концентрации фермента и концентрации субстрата, активаторов и ингибиторов и т.п.). Степень изменения активности от различных факторов можно определить по скорости ферментативной реакции. Мерой скорости ферментативной реакции служит количество субстрата, подвергшегося превращению в единицу времени, или количество образовавшегося продукта. При изучении влияния какого-либо фактора на скорость ферментативной реакции все прочие факторы должны оставаться неизменными и по возможности иметь оптимальные значения.

ВЛИЯНИЕ ТЕМПЕРАТУРЫ НА СКОРОСТЬ

ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ (на активность ферментов)

Скорость ферментативной реакции зависит от температуры. Оптимальным считается то значение ее, при котором реакция протекает с максимальной скоростью. Для большинства ферментов, выделенных из организма теплокровных и многих микроорганизмов оптимальная температура составляет 37-40 °С, для ферментов растительного происхождения – 40-50 ˚С. Повышение температуры сверх оптимальной приводит к уменьшению, а затем прекращению действия фермента, что связанно с денатурацией. При переходе от оптимальной к низким температурам скорость ферментативной реакции падает в 2-2,5 раза на каждые 10 ˚С, достигая минимальной величины при 0 °С и приостанавливается при отрицательных её значениях (минус 18 ˚С). Причиной является снижение скорости движения молекул субстратов и ферментов, что замедляет образование фермент-субстратного комплекса и проведения реакции. При повышении температуры от отрицательных значений действие ферментов восстанавливается, скорость катализируемых реакций возрастает в 2-2,5 раза на каждые 10 ˚С, до оптимальной температуры. Принцип снижения активности ферментов при понижении температуры используется при консервировании сырья и готовой продукции низкими температурами. Инактивация ферментов высокой температурой необратима, используется в пищевой промышленности для консервирования многих продуктов растительного и животного происхождения.

ХОД РАБОТЫ. В штативе располагают двумя рядами 8 пробирок (по 4 пробирки в ряду). Во все пробирки одного ряда наливают по 3 мл раствора крахмала; во все пробирки другого ряда по 0,5 мл вытяжки из солода. Первые пробирки из обоих рядов (одна с ферментом, другая с крахмалом) помещают в кипящую водяную баню, вторые – в термостат при 37-38 °С, третьи – в лед или снег, четвертые оставляют при комнатной температуре. Через 10 мин содержимое каждой пары пробирок объединяют вместе (приливают крахмал к ферменту), перемешивают и пробирки с содержимым оставляют в тех же условиях. Этот момент считать началом опыта.

Не теряя времени, берут 3 чистые пробирки, вносят в них по 0,5-1 мл воды и по 3 капли раствора йода. Эти пробирки нужны для наблюдения за ходом гидролиза крахмала амилазой по реакции с йодом.

По истечении 2-5 мин инкубации из пробирки, стоящей при комнатной температуре, отбирают 0,2-0,3 мл инкубируемой смеси и вносят ее в одну из пробирок с раствором йода. Если появляется синее или фиолетовое окрашивание, то все пробирки оставляют в тех же условиях еще на 5 мин. После истечения этого времени реакцию с йодом повторяют. В случае появления красных тонов окраски содержимого пробирки, стоящей при комнатной температуре, инкубацию прекращают. Сразу же все пробирки собирают в штатив и в каждую добавляют по 1 мл раствора с массовой долей серной (или соляной) кислоты 10 % и по 3 капли раствора йода, содержимое перемешивают.

Глубину гидролиза крахмала определяют по окраске с раствором йода, результат записывают в следующую таблицу.

Таблица 11

Влияние температуры на активность ферментов

На основании полученных данных строят график зависимости скорости ферментативной реакции от температуры. При построении графика по оси ординат, начиная от нуля, обозначить цвета в следующей последовательности: синий, фиолетовый, красный (объединяя все его тона), оранжевый, желтый; по оси абсцисс – температуру, обозначив разрыв между 40 и 100 °С. Записать принцип метода и сделать выводы.

РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; вытяжка из солода; раствор йода в йодиде калия; растворы с массовыми долями: крахмала 1 %, серной (или соляной) кислоты 10 %.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.

1. Перечислите факторы среды, влияющие на активность ферментов (скорость ферментативной реакции).

2. Назовите оптимальные температуры для ферментов животного, растительного и микробного происхождения.

3. Как влияет снижение температуры, от оптимальной до 0˚С и ниже, на скорость ферментативной реакции. Чем можно объяснить влияние этого фактора?

4. Как влияет повышение температуры от минусовых значений до оптимальной, на скорость ферментативной реакции?

5. Как влияет повышение температуры от оптимальной до 70 ˚ С и выше, на активность фермента. Чем объясняется влияние этого фактора?

6. Какая температура, в исследовании, была оптимальной, и как Вы это установили?

7. При каких температурах в исследовании, амилаза «не работала». Как Вы это установили? Объясните влияние этих факторов?

8. Практическое использование знаний о влиянии температуры на активность ферментов.

ВЛИЯНИЕ рН НА СКОРОСТЬ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ РЕАКЦИИ

Ферменты при постоянной температуре работают наиболее эффективно в пределах рН (от 2 до 10) . Оптимальным считается то значение рН, при котором реакция протекает с максимальной скоростью. Отклонение в любую сторону от этого значения сопровождается снижением скорости ферментативной реакции. Это объясняется тем, что ферменты имеют большое число полярных, положительно и отрицательно заряженных групп, участвующих в поддержании нативной конформации, образовании фермент-субстратного комплекса и проведении реакции.

Во многих случаях субстраты являются электролитами, и реакция осуществляется лишь с определенными (ионизированными или неионизированными) их формами, возникающими при оптимуме рН.

Многие ферменты являются двухкомпонентными (сложными белками), небелковый компонент которых слабо связан с белком ионными, водородными связями в условиях оптимума рН. Сдвиги рН за пределы оптимума вызывают диссоциацию кофактора и разрушение структуры активного центра. Например, пероксидаза диссоциирует в кислой среде на два компонента, однако при рН 7,0 её структура и активность восстанавливаются.

При очень низких и очень высоких значениях рН ферменты денатурируют.

ВЛИЯНИЕ рН НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ СЛЮНЫ

ХОД РАБОТЫ. Перед началом работы определяют активность амилазы слюны. Для чего в пробирке смешивают 2 мл раствора с массовой долей крахмала 1 % и 0,5 мл разбавленной 1:9 и профильтрованной слюны. Смесь оставляют при комнатной температуре. Наблюдение за ходом гидролиза крахмала проводят по реакции с раствором йода. Для чего каждые 5 мин отбирают по 3-4 капли гидролизата и вносят его в пробирку с заранее налитыми туда 0,5 мл воды и 3 каплями раствора йода. При появлении красно-бурой или красной окраски наблюдение прекращают. Желательно, чтобы гидролиз крахмала до эритродекстринов (красные тона окраски) происходил приблизительно за 10¸15 мин. Если гидролиз идет быстрее, то слюну нужно разбавить еще в 2 раза и опыт повторить. Найденное разбавление слюны используют для работы.

Нумеруют 5 пробирок и в каждую вносят по 4 мл буферного раствора с конкретным значением рН: 4,56; 5,72; 6,80; 7,96; 8,95 или близкими к каждому из этих значений. Пипетки после внесения каждого буферного раствора промывают. Во все пробирки добавляют по 2 мл раствора с массовой долей крахмала 1 % и по 0,5 мл разбавленной слюны. Содержимое перемешивают и пробирки оставляют при комнатной температуре. Наблюдение за ходом гидролиза крахмала ведут по реакции с раствором йода согласно методике, описанной на с. 42. Отбор проб производят из пробирки № 3 через каждые 5 мин. При появлении красного или желтого окрашивания содержимого сразу же во все пробирки вносят по 1 мл раствора с массовой долей соляной (или серной) кислоты 10 % и по 3 капли раствора йода. Содержимое перемешивают, результат вносят в табл. 12.

Таблица 12

Влияние рН на активность амилазы слюны

__________

^* При оформлении работы записать значения рН, указанные на флаконах.

По результатам работы построить график зависимости активности амилазы слюны от рН и сделать вывод. Порядок построения графика описан в предыдущей работе. Записать принцип метода.

ВЛИЯНИЕ рН НА АКТИВНОСТЬ АМИЛАЗЫ СОЛОДА.

ХОД РАБОТЫ. Нумеруют 5 пробирок и в каждую вносят по 4 мл буферного раствора со следующими значениями рН: 2,87; 4,10; 5,33; 6,59; и 7,96 или близкими к каждому из этих значений. Пипетки после внесения каждого буферного раствора промывают. Во все пробирки добавляют по 2 мл раствора крахмала и по 0,5 мл вытяжки из солода. Содержимое перемешивают и в дальнейшем поступают точно так же, как описано на с. 42. Результат оформить в виде таблицы.

Таблица 13

Влияние рН на активность амилазы солода

____________

^* При оформлении работы записать значения рН, указанные на флаконах.

Записать принцип метода, построить график глубины гидролиза крахмала амилазой солода в зависимости от рН.

РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; раствор йода в йодиде калия; вытяжка из солода; слюна разбавленная 1:9 (фильтрованная); растворы с массовыми долями: крахмала 1 %, серной (или соляной) кислоты 10 %; растворы для приготовления смесей с заданными значениями рН (раствор № 1 с рН 1,81: в колбе вместимостью 1 л растворяют 0,04 моль борной кислоты, 0,04 моль фосфорной кислоты, 0,04 моль уксусной кислоты; раствор № 2: представляет собой раствор с концентрацией гидроксида натрия 0,2 моль/л). Буферные растворы нужных значений рН готовят смешение раствора № 1 и раствора № 2 в соответствии с табл. 14.

Таблица 14

Составление буферных растворов

После смешения фактическое значение рН определить на рН-метре, добавлением раствора № 1 или № 2 максимально приблизить к заданной величине и написать на флаконе.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.

1. Как определить изменение активности амилазы под влиянием рН?

2. Характеристика оптимальных рН и её параметры для амилазы солода и слюны.

3. Каковы физико-химические основы влияния оптимальной рН на активность ферментов?

4. Каковы физико-химические основы влияния на активность ферментов сдвига рН от зоны оптимума в любую сторону?

5. Практическое применение знаний о влиянии рН на скорость ферментативных реакций и процессов.

3.5. Выделение α- и β- амилаз из солода и определение их активности

В солоде (проросшем зерне пшеницы, ржи, ячменя) содержатся активные α- и β- амилазы. Они хорошо растворяются в воде, поэтому их можно получить в виде водной вытяжки.

Выделение α- и β- амилазы из солодовой водной вытяжки основано на различной устойчивости этих ферментов к температуре и рН среды. При нагревании солодовой вытяжки до 70 ºС β-амилаза денатурирует, тогда как α-амилаза при этой температуре сохраняет нативную конформацию и активность. Оптимум действия β-амилазы проявляется при рН 4,8, однако α-амилаза при таких значениях рН теряет свою активность, а при понижении до рН 3,3 – денатурирует.

ВЫДЕЛЕНИЕ α-АМИЛАЗЫ. В пробирку вносят 5 мл солодовой вытяжки, содержащей активные α- и β-амилазы, добавляют на кончике ножа порошок ацетата кальция и пробирку выдерживают в течении 15 мин. на водяной бане, нагретой до 68 ºС (в период нагревания температура воды не должна подниматься выше 70 ºС и опускаться ниже 66 ºС). Затем содержимое пробирки охлаждают холодной водой. При таком прогревании β-амилаза полностью инактивируется, а α-амилаза сохраняет свою активность. Полученный раствор используют для определения активности α-амилазы.

ВЫДЕЛЕНИЕ β-АМИЛАЗЫ. В колбу вместимостью 50 мл вносят 5 мл солодовой вытяжки, содержащей активные α- и β-амилазы, добавляют 4 мл воды, 1 мл раствора с концентрацией соляной кислоты равной 0,1 моль/л (рН полученной смеси должен быть 3,3). Затем колбу с содержимым помещают на 15 мин на снег или лед (можно в морозильную камеру холодильника). В этих условиях α-амилаза полностью инактивируется, а β-амилаза сохраняет свою активность. По истечении 15 мин выдержки на холоде к содержимому колбы добавляют 2 мл раствора с концентрацией гидрофосфата натрия (Na₂HPO₄) 0,15 моль/л для того, чтобы рН довести до 6,0. Полученный раствор используют для определения активности β-амилазы.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ АМИЛАЗ СОЛОДА

(по массе гидролизованного крахмала)

Действие амилаз на крахмал можно установить либо по убыли крахмала, либо по накоплению продуктов его распада – сахара.

Метод определения активности амилаз по массе расщепленного крахмала получил название колориметрического.

Принцип метода состоит в том, что активность амилаз рассчитывают по разности между массами взятого для опыта и оставшегося по окончании опыта нерасщепленным крахмала, определяемого фотометрическим анализом по цветной реакции с йодом. При проведении опыта продолжительность инкубации и объем раствора ферментного препарата устанавливают такими, чтобы в опытных пробирках (содержащих фермент) не произошел полный гидролиз крахмала.

Данный метод позволяет установить специфичность и активность совместного действия амилаз на крахмал. α-Амилаза (КФ 3.2.1.1.) гидролизует в крахмале и родственных полисахаридах α-1,4-гликозидные связи без определенного порядка. В результате образуются декстрины и незначительное количество мальтозы. β-Амилаза (КФ 3.2.1.2.) гидролизует в крахмале и родственных полисахаридах α-1,4-гликозидные связи, последовательно отщепляя молекулы мальтозы с нередуцирующих концов цепочек.

Наиболее эффективно гидролиз осуществляется под действием комплекса амилаз, содержащихся в вытяжке из солода.

ХОД РАБОТЫ. Для проведения опыта берут 6 пробирок, одна из них контрольная. Пробирки заполняют в соответствии с табл. 15.

Таблица 15

Определение активности амилаз солода

Содержимое в пробирках перемешивают и ставят в термостат при 37-38 ºС на 30 мин. Такая постановка опыта позволяет одновременно определить суммарную активность амилаз в солодовой вытяжке (α- и β-амилаз вместе), активность α-амилазы и активность β-амилазы. По окончании времени инкубации пробирки из термостата вынимают и в каждую немедленно добавляют по 2 мл раствора с концентрацией соляной кислоты 1моль/л и по 3 капли водного раствора йода; содержимое перемешать.

Пробирки с содержимым, окрашенным в желтые тона, убирают. Пробирки с содержимым, окрашенным в синие, фиолетовые или красные тона оставляют для дальнейшей работы (если после добавления раствора йода все пробирки с одним и тем же ферментным препаратом будут окрашены в желтый цвет, то опыт следует повторить, взяв этот ферментный препарат в меньшем количестве).

Берут мерные колбы вместимостью 50 мл, нумеруют их соответственно номерам, оставленных для дальнейшей работы пробирок. В каждую колбу вносят 30-40 мл воды, 0,5 мл раствора с концентрацией соляной кислоты 1моль/л, 10 капель водного раствора йода и 0,5 мл смеси из пробирки в соответствии с номером колбы. Непосредственно перед отбором смеси содержимое пробирки перемешивают. Содержимое колбы доводят до метки водой, перемешивают и колориметрируют на ФЭКе при красном светофильтре против воды.

Активность амилаз выражают в мг расщепленного крахмала на 1г солода (или другого материала) за 1 мин. Расчет производят следующим образом:

- определяют массу расщепленного крахмала по формуле:

Е_к – Е_о

m = • С,

Е_к

где, m – масса расщепленного крахмала за время опыта, мг;

Е_к – оптическая плотность контрольного раствора;

Е_о – оптическая плотность опытного раствора;

С – масса внесенного крахмала, мг (3 мл раствора с массовой долей крахмала 2 % содержат 60 мг крахмала);

- полученный результат умножают на разбавление (см. табл. 15), т.е. приводят к 1 мл исходной ферментной вытяжки и затем делят на время инкубации (30 мин), что позволяет выразить активность амилазы в мг расщепленного крахмала 1 мл ферментной вытяжки за 1 мин.

Зная методику приготовления вытяжки из биологического объекта, можно легко рассчитать активность амилазы в мг расщепленного крахмала на 1 г биологического материала за 1 мин по формуле:

(Е_к – Е_о)• 60 •V

А = ,

Е_к• V₁• m• 30

где, А – активность амилазы в мг расщепленного крахмала на 1г солода (или другого материала) за 1мин;

Е_к – оптическая плотность контрольного раствора;

Е_о – оптическая плотность опытного раствора; 60 – масса взятого для анализа крахмала, мг (в 3 мл 2 % раствора содержится 60 мг крахмала);

V – общий объем солодовой вытяжки, полученной из солода (100 мл);

V₁ – объем ферментного препарата, взятого для инкубирования, мл;

30 – время инкубации, мин;

m – масса солода, взятого для приготовления солодовой вытяжки.

При расчете активности β-амилазы в числитель необходимо ввести число 2,4, которое учитывает все разведения солодовой вытяжки, сделанные при выделении β-амилазы.

Результаты исследований записывают и делают выводы об активности амилаз солода.

РЕАКТИВЫ. Вода дистиллированная; вытяжка из солода (приготовление см. с. 38); ацетатный буфер pH 5,5 (к 57,4 мл раствора с концентрацией уксусной кислоты 1 моль/л добавляют 50 мл раствора с концентрацией гидроксида натрия 1 моль/л и общий объем доводят водой до 500 мл); раствор с массовой долей крахмала 2 % (суспензируют 2 г растворимого крахмала в 20мл холодной воды, затем при помешивании добавляют 80 мл кипящей воды и кипятят 1 мин, после охлаждения объем доводят водой до 100 мл и содержимое перемешивают); раствор с концентрацией соляной кислоты 1 моль/л; раствор с массовой долей йода 0,3 % в растворе с массовой долей йодида калия 3 % (0,3 г йода кристаллического и 3 г йодида калия смешивают с 3-5 мл воды и после растворения йода объем доводят водой до 100 мл).

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ.

1. Общая характеристика солода.

2. Какие ферменты содержатся в солоде и как их можно выделить?

3. Техника выделения α-амилазы. На чем она основана?

4. Метод выделения β-амилазы, на чем он основан?

5. Специфичность действия и активность α-амилазы.

6. Специфичность действия и активность β-амилазы.

7. Принцип колориметрического метода определения активности амилаз? Что положено в основу?

8. Расчет активности и характеристика полученных результатов.