При необходимости после хроматографического разделения и проявления алкалоидов аналогичным способом можно определить сенецифиллин, пользуясь тем же калибровочным графиком

Построение калибровочного графика. 0,2890 г (точная навеска) гидротартрата платифиллина помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 50 мл дистиллированной воды, объем раствора доводят до метки "95%-ным этиловым спиртом и перемешивают. Получают таким обра­зом 0,2%-ный исходный раствор платифиллина-основания. Для построения ка­либровочного графика, рассчитанного на работу в кювете с толщиной слоя раст­вора 50 мм, наносят на стартовую линию хроматограммы в разные точки (0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 0,07 мл) исходного раствора, что соответствует 20, 40, 60, 80, 100, 120 и 140 мкг платифиллина-основания, и далее анализируют, как описано выше. Для кюветы с толщиной слоя раствора 10 мм берут 0,05; 0,10; 0,15; 0,20; 0,25 мл исходного раствора, что соответствует 100, 200, 300, 400 и 500 мкг платифиллина-основания, и далее анализируют, как описано выше

При построении калибровочного графика на оси абсцисс откладывают коли­чество мкг вещества, содержащегося в пятне хроматограммы, а на оси ординат — оптические плотности соответствующих колориметрируемых растворов.

Приготовление пластинок для хроматограммы. Смешивают 95 г порошка силикагеля с 5 г CaS0₄; к 1,5 г этой смеси добавляют 4 мл 0,1 н. раствора NaOH и размешивают до консистенции «жидкой сметаны». Полу­ченную смесь наливают ровным слоем на стеклянную пластинку 6 X 18 см. Пла­стинку с сорбентом сушат на воздухе в течение 18 ч.

Реактивы и оборудование: H₂S0₄ 5%-ная; НС1 1%-ная; аммиак (конц. р-р); цинк металлический (цинковая пыль); этиловый эфир; этиловый спирт; хлороформ; фенолфталеин; кремневольфрамовая кислота; Na₂S0₄ (без- водн.); CaS0₄; тропеолин 000-II; реактив Драгендорфа; платифиллин гидротарт- рат; вода дистиллированная; силикагель марки КСК; бумага фильтровальная; вата гигроскопическая; колбы вместимостью 100, 200 и 1000 мл; колбы мерные вместимостью 50 мл; воронки делительные вместимостью 250—300 мл; воронки стеклянные для фильтрования диаметром 5 и 10 см; цилиндры мерные на 10, 100 и 500 мл; пластинки стеклянные для ТСХ размером 6 X 18 см; камеры хро- матографические для ТСХ; микропипетки измерительные вместимостью 0,2 мл; бюксы с притертой крышкой; эксикатор; бани водяные лабораторные; весы руч­ные; весы лабораторные аналитические; сито с диаметром отверстий 2 мм; ступка фарфоровая с пестиком; электрокофемолка бытовая; фотоэлектроколориметр ФЭК-56 М; шкаф сушильный лабораторный; штативы лабораторные.

СН3 эрготамин эргометрин

Методика количественного определения алкалоидов в рожках_я спорыньи эрготаминового штамма (Cornua Secalis cornuti stamm Ergotamini) (ФС 42-1432-80). Рожки спорыньи, паразитирующей на ржи, содержат индольные алкалоиды — производные лизерги- новой и изомерной ей изолизергиновой кислот. Основными являются эргометрин, эрготамин, эргокристин, эргокриптин, эргокорнин и др.:

Количественное определение алкалоидов проводится колориметри­ческим методом. 3 г (с погрешностью не более 0,01 г) свежеизмель- ченного порошка спорыньи, просеянного сквозь сито с размером отверстий 0,315 мм, обезжиривают в аппарате Сокслета в течение 8 ч петролейным эфиром (температура кипения 40—60 °С). Обезжи­ренный порошок высушивают при температуре не выше 30 °С и пе­реносят количественно в колбу с притертой пробкой вместимостью 100 мл, приливают 30 мл этилового эфира и оставляют на 10 мин. Затем прибавляют 0,13 г свежепрокаленного оксида магния, тща­тельно растертого с 6 мл воды; смесь непрерывно встряхивают в течение 2 ч, затем прибавляют 6 г безводного Na₂S0₄, сильно встряхивают в течение 5 мин, дают отстояться и быстро процежи­вают через вату. 15 мл фильтрата (1,5 г спорыньи) помещают в де­лительную воронку и извлекают 4 раза по 20 мл 2%-ным раствором винной кислоты; колбу с объединенными виннокислыми извлече­ниями помещают на водяную баню и нагревают до 40—50 °С для удаления остатков эфира.

Охлажденный раствор процеживают через вату в мерную колбу вместимостью 200 мл, колбу и воронку с ватой тщательно промы­вают 2%-ным раствором винной кислоты и доводят объем раствора до метки той же кислотой (раствор А). К 2 мл раствора А прибав­ляют 4 мл реактива ван-Урка, перемешивают и оставляют раствор на свету на 30 мин, после чего колориметрируют на ФЭК-М с зеле­ным светофильтром (длина волны 530—540 нм) в кювете с толщиной слоя 10 мм.

Процентное содержание эргоалк^лоидов в сырье х вычисляют по формуле

_ а200- 100-100 1,5 (100—ш) '

где а — количество эргоалкалоидов в 1 мл раствора А, г, найден­ное по калибровочному графику; w — потеря в массе сырья при высушивании, %.

Построение калибровочного графика. Для построения калибровочного графика готовят серию разведений эрготамина тартрата-стандарта (ФС 42-1070-76) в 2%-ной винной кислоте разбавлением исходного раствора эрготамина тартрата- стандарта. Для этого сначала готовят исходный раствор: точную навеску 0,0113 г эрготамина тартрата-стандарта (0,0100 г основания) растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в 2%-ной винной кислоте и доводят этой же кислотой до метки. Полученный раствор содержит 0,0001 г эрготамина-основания в 1 мл (исходный раствор). В пробирках вместимостью 10 мл готовят следующий ряд разбав­лений раствора (см. табл. на стр. 156).

К полученным растворам прибавляют 4 мл раствора ван-Урка, тщательно перемешивают и оставляют раствор на свету на 30 мин, после чего колориметрируют в тех же условиях, что и в основном опыте. Строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс количество граммов эрготамина-основания, а на оси ординат —

соответствующее значение оптической плотности колориметрируе- мых растворов.

Для определения содержания эрготамина на стартовую линию хроматографической бумаги марки «С» (55 X 16 см) узкой полоской наносят из микропипетки 0,4 мл эфирного извлечения (0,04 г спо­рыньи). Бумагу импрегнируют 50%-ным спиртовым раствором формамида, рН которого 7,05—7,20, оставляя стартовую линию в 2 см сухой; тщательно отжимают избыток формамида между листами фильтровальной бумаги, стартовую линию опрыскивают из пульверизатора тем же раствором формамида. В течение 10 мин полоску бумаги высушивают на воздухе в темном месте.

Хроматографирование проводится в затемненной камере нисхо­дящим методом, в системе бензол — петролейный эфир (/_КИп — = 70—100 °С) (6:1) до продвижения фронта 40—45 см, после чего бумагу высушивают и просматривают в ультрафиолетовом свете, отмечают светящуюся полоску эрготамина. Эту полоску вырезают по всей ширине бумаги — с одного конца вырезают зубчики, другим концом помещают в кювету с 1 %-ной винной кислотой, которая находится в камере, насыщенной водой, и алка­лоиды элюируют 1 %-дой винной кислотой, элюат собирают в про­бирку с делениями. За 18 ч собирают 3—6 мл элюата, доводят водой до 8 мл, тщательно перемешивают. К 2 мл полученного раст­вора прибавляют 4 мл реактива ван-Урка и через 30 мин колори- метрируют в тех же условиях, что и при определении суммы алка­лоидов.

По калибровочному графику находят содержание эрготамина в 1 мл испытуемого раствора. Процентное содержание х вычисляют по формуле

_ а8 • 100 ■ too

⁴ ~ 0,04 (100-а») '

где а — количество эрготамина в 1 мл испытуемого раствора, г, найденное по калибровочному графику; w — потеря в массе сырья при высушивании, %. Содержание эрготамина в пересчете на абсо­лютно сухое сырье должно быть не менее 0,2 %.

Построение калибровочного графика. Для построения калибровочного графика точную навеску 0,0113 г эрготамина тартрата-стандарта (0,0100 г эрготамина-основания) растворяют в 10 мл метилового спирта. На стартовую линию хроматографической бумаги марки «С» (55 X 16 см) узкой полоской наносят из микропипетки на первый лист 0,05 мл, на второй — 0,1, на третий —0,15, на четвертый —0,2 мл этого раствора (50, 100, 150, 200 мкг), далее поступают, как описано выше.

При количественном определении алкалоидов в рожках спорыньи на лабо­раторных занятиях указанную навеску сырья (3 г) предварительно обезжиривают; калибровочный график студенту дается готовый.

Реактивы и оборудование: петролейный эфир (<_киП = 40—60 и 70—100 °С); этиловый эфир; бензол; этиловый спирт (этанол); MgO, Na₂S0₄ (безводн.); винная кислота; эрготамин тартрат; формамид (50%-ный раствор в этиловом спирте); реактив ван-Урка (H₂S0₄ кони.,FeCl₃, п-диметиламинобен- зальдегид).

Бумага хроматографическая; бумага фильтровальная; колбы с притертой пробкой вместимостью 100 мл; колбы конические вместимостью 100 мл; воронки стеклянные для фильтрования диаметром 5 см; воронки делительные вместимостью 100 мл; стаканы химические вместимостью 200 мл; колбы мерные вместимостью 100 и 200 мл; пипетки измерительные вместимостью 2 и 5 мл; цилиндры мерные на 10 и 100 мл; бюксы с притертой дсрышкой; пробирки вместимостью 10 мл; ка­мера хроматографическая для БХ; эксикатор; пульверизатор; штативы для де­лительных воронок; бани водяные лабораторные; аппарат Сокслета; шкаф су­шильный лабораторный; УФ лампа; весы ручные; весы лабораторные аналити­ческие; сито с размером отверстий 0,315 мм; фотоэлектроколориметр ФЭК-М.

Методика количественного определения секуринина в побегах секуринеги (Cormus Securinegae) (ФС 42-109). Побеги секуринеги полукустарниковой Securinega suffruticosa (Pall.) Rehd. сем. моло­чайных — Euphorbiaceae содержат алкалоиды — производные кон­денсированной бициклической системы пиперидина и пирролидина:

о

II

секуриыив

Количественное определение секуринина в сырье проводится полярометрическим методом. 100 г воздушно-сухого сырья, измель­ченного до величины частиц 2 мм, помещают в коническую колбу вместимостью 2000 мл и заливают 1000 мл дистиллированной воды. Содержимое колбы взбалтывают 5 мин и оставляют до следующего дня. После этого повторно взбалтывают 5 мин и водную вытяжку отфильтровывают.

600 мл водного фильтрата помещают в делительную воронку вместимостью 1000 мл, подщелачивают концентрированным раство­ром аммиака (проба с фенолфталеиновой бумагой) и алкалоиды исчерпывающе извлекают хлороформом 3—4 раза порциями 100, 50 и 50 мл до полного извлечения (проба с раствором кремневольфра­мовой кислоты).

Из объединенного хлороформного извлечения алкалоиды извле­кают 10%-ной H₂S0₄ 2—3 раза по 50 мл в делительной воронке вместимостью 500 мл. Объединенный сернокислый раствор вновь подщелачивают концентрированным раствором аммиака (проба с фенолфталеиновой бумагой) и алкалоиды исчерпывающе извле­кают этиловым эфиром 4—5 раз по 30—50 мл (проба с раствором кремневольфрамовой кислоты). Объединенные эфирные извлечения сушат безводным Na₂S0₄ (10—15 г) и фильтруют через бумажный фильтр в сухую колбу. Промывают сульфат натрия небольшими порциями этилового эфира до отсутствия алкалоидов и фильтруют через тот же фильтр. Эфир обгоняют на водяной бане досуха. Оста­ток эфира удаляют струей воздуха.

Сухой остаток в колбе растворяют в 5 мл 95 %-ного этилового спирта и количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 мл, объем раствора доводят до метки этиловым спиртом, тща­тельно перемешивают и определяют угол вращения в трубке дли­ной 0,5—2,0 дм (поляриметр марки СМ).

1. Для приготовления 10%-ной H_sS0₄ берут 1 часть конц HaS0₄ и 9,5 ча­стей Н_гО.

2. При отгонке эфира следует избегать перегрева кристаллизующихся алка­лоидов. Выделенные алкалоиды необходимо сразу же растворить в 95%-ном эти­ловом спирте, не оставляя на следующий день.

Процентное содержание секуринина х вычисляют по формуле

aWilOO • 100 * V_am/1080 (100—w) »

где а — измеренный угол вращения, градусы; V — объем раство­рителя, взятого для извлечения алкалоидов, мл; У*— объем извле­чения, взятого для анализа, мл; V₂ — объем этилового спирта, взятого для растворения алкалоидов, мл; т — масса навески сырья^-, г; I — толщина слоя жидкости (длина трубки), дм; w — потеря в массе сырья при высушивании, %; 1080 — удельное вра­щение чистого секуринина.

Содержание секуринина должно быть не менее 0,1 % на абсо­лютно сухое сырье.

Реактивы и оборудование: аммиак (конц. р-р); HjSOj1%-ная; кремневольфрамовая кислота; этиловый эфир; этиловый спирт (этанол); вода ди­стиллированная; хлороформ; Na₂S0₄ (безводн.); фенолфталеиновая бумага.

Бумага фильтровальная; колбы конические вместимостью 250 и 2000 мл; цилиндры мерные на 10, 100 и 1000 мл; колбы мерные вместимостью 25 мл; во­ронки стеклянные для фильтрования диаметром 5 и 10 см; воронки делительные вместимостью 500 и 1000 мл; установка для отгонки этилового эфира; поляри­метр; штативы для делительных воронок; весы лабораторные аналитические; весы ручные; бюксы с притертой крышкой, эксикатор; сушильный шкаф лабора­торный

Методики количественного определения берберина в корнях барбариса обыкновенного (Radix Berberidis vulgaris).

Корни барбариса обыкновенного (Berberis vulgaris L.) сем. барбарисовых — Berberidaceae содержат алкалоиды производные изохинолина: берберин, ятроррицин, пальматин и др. Считают, что берберин может быть как в форме четвертичного аммонийного

ill

Количественное определение берберина спектрофотометрическим методом (ФС 42-1152- 78). Количественное определение берберина в корнях барбариса по данной методике основано на селективном извлечении берберина в его карбинольной форме и отделении от алкалоидов фенольной природы на стадии экстракции сырья.

В УФ спектре бисульфата берберина в 2%-ной H_aS0₄ имеется ряд интенсивных полос поглощения- Для количественного опреде­ления в данном методе используется наиболее длинноволновая полоса поглощения (Я_тах = 420 нм).

Для определения* содержания берберина от средней пробы цельного сырья отделяют не менее 1 кг, который измельчают до частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 7 мм, тща­тельно перемешивают, отбирают не менее 250 г сырья, которые измельчают до частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отвер­стий 3 мм. Затем отбирают 25 г сырья и доводят его измельчение до частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм.

I II

0-,5 г (с погрешностью не более 0,0001 г) сырья помещают в ко­ническую плоскодонную колбу вместимостью 100 мл (с притертой пробкой), прибавляют 0,5 мл 25%-ного NaOH, тщательно пере­мешивают стеклянной палочкой до получения однородной увлаж­ненной массы, закрывают пробкой и оставляют при комнатной температуре на 2 ч. Затем в колбу прибавляют 50 мл этилового эфира, закрывают пробкой, взвешивают (с погрешностью не бо­лее 0,01 г). Содержимое колбы осторожно перемешивают круго­выми движениями в течение 10 мин, взвешивают и потерю массы пополняют этиловым эфиром. Содержимое колбы вновь осторожно перемешивают, дают отстояться, затем берут осторожно, не взму­чивая сырье, пипеткой 15 мл эфирного извлечения, помещают

в делительную воронку вместимостью 100 мл и проводят извлече­ние алкалоидов 2 %-ной H₂S0₄ порциями 20, 10 и 10 мл (до отрица­тельной реакции с кремневольфрамовой кислотой). Объединенные кислотные извлечения помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл и доводят объем раствора до метки 2%-ной H₂S0₄. После тщательного перемешивания раствор спектрофотометрируют при длине волны 420 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.

Процентное содержание берберина бисульфата х в пересчете на абсолютно сухое сырье вычисляют по формуле

50 • 50 • 100D 15 • 128т (100 — ш) '

где 50 — объем эфирного извлечения, мл; 50 — объем сернокислого извлечения, мл; 15 — объем эфирного извлечения, взятого для ана­лиза, мл; 128 — удельный показатель поглощения берберина бисульфата при длине волны 420 нм; D — оптическая плотность сернокислого извлечения; т. — масса навески сырья, г; w — по­теря в массе сырья при высушивании, %.

Реактивы и оборудование: NaOH; этиловый эфир; H₂S0₄ 2%-ная; кремневольфрамовая кислота

Колбы конические с притертой пробкой вместимостью 100 мл; колбы мер­ные вместимостью 50 мл; воронки делительные вместимостью 100 мл; пипетки из­мерительные 1 и 15 мл; цилиндры мерные на 10 и 50 мл; бюксы с притертой крыш­кой; эксикатор; штативы для делительных воронок; шкаф сушильный лаборатор­ный; весы лабораторные аналитические, технические, ручные; сита с диаметром отверстий 1, 3 и 7 мм, спектрофотометр СФ-4А.

Количественное определение берберина спектрофотометрическим методом с приме- , нением хроматографии в tqhkom слое сор­бента. Метод основан на разделении алкалоидов в тонком слое сорбента и определении содержания берберина спектрофотометри­ческим методом.

Точная навеска (0,5—1 г) измельченных корней барбариса, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 1 мм, помещают в колбу вместимостью 50 мл, приливают 10 мл 95%-ного этилового спирта и нагревают с обратным холодильником на водяной бане, поддерживая слабое кипение этилового спирта в течение 30 мин. После охлаждения до комнатной температуры отмеряют микро­пипеткой 0,2 мл извлечения (надосадочной жидкости) и наносят на стартовую линию хроматографической пластинки с закреплен­ным слоем силикагеля сплошной полосой длиной 5—7 см на рас­стоянии 1,5 см от нижнего края пластинки. Для определения зоны берберина в правой части пластинки на стартовую линию наносят раствор берберина бисульфата (3—5 капилляров) в виде пятна (диаметр пятна 0,5—0,7 мм).

После высушивания пластинку помещают в хроматографическую камеру. Для проявления используется система: раствор аммиака концентрированный — хлороформ —'этиловый спирт (1:3: 3). Си­стема растворителей используется для хроматографирования одно­кратно. Толщина слоя растворителей в хроматографической камере около 5 мм; экспозиция при комнатной температуре 30—40 мин.

Хроматограмму после высушивания просматривают в УФ свете, отмечают на хроматограмме зону, соответствующую берберину, и соскабливают этот участок сорбента скальпелем в колбу вмести­мостью 25 мл. Берберин 4 раза элюируют 0,1 н. H₂S0₄ при нагре­вании в течение 1 мин на водяной бане. Кислоту отмеряют с по­мощью бюретки: первый раз 4 мл, а затем три раза по 2 мл. Пол­ноту элюирования определяют по отсутствию флюоресценции сили­кагеля в УФ свете. Элюат каждый раз сливают декантацией в дру­гую колбу вместимостью 25 мл. Для удаления следов силикагеля объединенный элюат центрифугируют в течение 5 мин (1000 об/мин). Оптическую плотность элюата измеряют на спектрофотометре СФ-4А на фоне контроля при длине волны 345 нм в кювете с тол­щиной слоя 1 см. Контролем служит элюат чистого силикагеля с той же пластинки, снятый с площади, равной площади пятна берберина. Процентное содержание берберина в обрйзце х рассчи­тывают на абсолютно сухую массу сырья в пересчете на бисульфат берберина:

_ VV, 100Р * V_tmт (100—да) '

где V — объем этилового спирта, взятого для извлечения, мл; Vx — объем извлечения, нанесенного на хроматограмму, мл; V₂ — объем элюата берберина, мл; D — оптическая плотность элюата; w — потеря в массе сырья при высушивании, %; т — масса на­вески сырья, г; (646) — удельный показатель поглощения берберина бисульфата.

Реактивы и оборудование: этиловый спирт (этанол); CaS0₄; аммиак (конц); H₂S0₄ (0,1 н.); хлороформ; силикагель марки КСК-

Колбы с нормальным шлифом вместимостью 50 мл; холодильники обратные стеклянные лабораторные с нормальным шлифом; микропипетки измерительные вместимостью 0,2 мл; капилляры стеклянные; бюретки вместимостью 10, 25 мл; колбы конические вместимостью 25 мл; бани водяные лабора1Ърные; цилиндры мерные на 10 и 100 мл; бюксы с притертой крышкой; камера хроматографическая для ТСХ; пластинки стеклянные для ТСХ размером 13 X 18 см; штативы лабора­торные; центрифуга лабораторная; УФ лампа; шкаф сушильный лабораторный; сито с диаметром отверстий 1 мм; весы ручные; весы лабораторные аналитиче­ские, спектрофотометр СФ-4А

Вопросы для подготовки

1. Какие природные вещества называют алкалоидами (определение)?