Но о он

I

/\/\/Л

\/\/\/-\сн₂он

Н^/хГл XXIV

§ 2. Физико-химические свойства

Антраценпроизводные — кристаллические вещества желтого, оранжевого или красного цвета. Свободные агликоны хорошо растворяются в этиловом эфире, хлороформе, бензоле и других органических растворителях; в воде не растворяются, но хорошо растворимы в водных растворах щелочей за счет образования фено­лятов.

В форме гликозидов антраценпроизводные хорошо растворя­ются в воде, еще лучше — в щелочи, хуже — этаноле и метаноле; нерастворимы в органических растворителях — бензоле, этиловом эфире, хлороформе и др.

При нагревании до 210 °С антраценпроизводные сублимируются.

Большинство антраценпроизводных флуоресцирует при воз- ждении УФ и сине-фиолетовым светом. При этом характер флуо- :ценции зависит как от степени окисленности основного ядра, к и от числа и расположения заместителей: антрахиноны харак- ризуются, как правило, оранжевой, розовой, красной и огненно- асной флуоресценцией; антроны и антранолы — желтой, голу- й, фиолетовой.

§ 3. Методы выделения и идентификация

Для выделения антрагликозидов растительный материал экстра- руют водой, спиртами (этиловым, метиловым) или водно-спирто- ши смесями. Агликоны лучше растворимы в органических раство- ггелях, но растворимость их избирательная. Для получения агли- )нов гликозиды в растительном материале*подвергают гидролизу, 1гревая с кислотой, или энзиматическому расщеплению, после :го извлекают свободные агликоны этиловым эфиром, бензолом ни хлороформом. Антрахиноны, имеющие в качестве заместителя эрбоксильную группу, растворяются в водных растворах карбо- атов и гидрокарбонатов щелочных металлов и их гидроксидов образованием солей. Антрахиноны с гидроксилом в (J-положении г взаимодействуют с гидрокарбонатами, а с водными растворами арбонатов и гидроксидов щелочных металлов дают феноляты. 1ещества, содержащие а-гидроксил, образуют феноляты только растворах щелочей. Различие свойств оксигрупп в а- и Р-положе- иях объясняется тем, что а-гидроксилы образуют внутримолеку- ярную водородную связь с соседней карбонильной группой и по­тому обладают меньшей реакционной способностью:

На различии свойств антраценпроизводных в зависимости от характера и расположения заместителей основаны все классические летоды разделения этих соединений. Основным методом разделения штраценпроизводных является хроматографический. В качестве сорбента при этом наиболее успешно применяется полиамид; хоро­шие результаты дает также силикагель. Растворителями при раз- целении антрагликозидов служат главным образом водно-спиртовые смеси, а при разделении агликонов — бензол, толуол, хлороформ.

Идентификация проводится с помощью химических и физических методов, которые дополняют друг друга. Из физических методов наиболее полную информацию дают спектральные, которые позво­ляют установить класс соединений, а также наличие и характер заместителей.

УФ спектроскопия широко используется в структурных иссле­дованиях антраценпроизводных. В УФ области эти соединения имеют несколько максимумов поглощения выше 200 нм. Каждый тип за­мещения характеризуется определенным набором спектральных характеристик, что используется при установлении структуры новых соединений этой группы (рис. 12).

ИК спектроскопия нашла наи­более широкое применение при изучении структуры антраценпро­изводных, так как ИК спектры этих соединений специфичны и мо­гут быть использованы для иден­тификации. Наличие ароматичес­ких колец в антрахиноне обуслов­ливает появление интенсивной по­лосы в области 1578—1596 см^-1 (рис. 13). Производные антрахи- нона, не имеющие а-гидроксилов, дают одну сильную полосу в обла­сти 1678—1653 см^-1, обусловленную

карбонильными группами хиноидного кольца. а-Гидроксилы харак­теризуются широкой полосой с центром 2900 см"¹, что объясняется образованием внутримолекулярной водородной связи между а-гиД- роксилами и хиноидным карбонилом. (З-Гидроксильные группы мо­гут быть определены по появлению полосы в области 3400—3150 см^-1,

что типично для оксигрупп, способных образовывать межмолеку­лярные водородные связи. У производных антрона свободная кар­бонильная группа хиноидного кольца поглощает в области 1654 см^-1. Таким образом, при изучении структуры антраценпроизводных с помощью инфракрасной спектроскопии используют главным об­разом частоту поглощения отдельных групп и заместителей соеди­нения.

ЯМР спектроскопия также находит применение для изучения :труктуры антраценпроизводных. Характер спектра ядерного маг­нитного резонанса в основном определяется числом и положением ароматических протонов, а также положением и строением водород- содержащих заместителей.

§ 4. Качественное определение

Методики качественных реакций. 1. Реакция со щелочью. 0,2 г измельченного растительного материала кипятят в течение 2 мин с 5 мл 10%-ного NaOH. После остывания смесь разбавляют 5 мл воды и фильтруют. 3 мл фильтрата помещают в пробирку, добавляют 3 мл 10%-ной НС1 и 10 мл бензола. Осторожно перемешивают и после расслоения жидкости сливают бензольный слой, фильтруя его через небольшой комочек ваты. Фильтрат встряхивают с 3 мл 10%-ного раствора аммиака.

При наличии антраценпроизводных аммиачный слой принимает вишнево-красное (1,8-диоксиантрахиноны), пурпурное (1,4-диокси- антрахиноны) или фиолетовое (1,2-диоксиантрахиноны) окрашива­ние.

Сущность реакции в следующем: при кипячении растительного материала со щелочью происходит гидролиз-антрагликозидов с об­разованием свободных агликонов. Одновременно антрон- и антра- нолпроизводные окисляются до антрахинонов. Образовавшиеся оксиантрахиноны за счет фенольных гидроксилов дают феноляты, растворимые в воде. При подкислении водно-щелочного извлечения диссоциация фенольных гидроксилов подавляется и соединения становятся липофильными, в результате чего при встряхивании с бензолом они из водного слоя переходят в бензол; бензольный слой при этом принимает желтую окраску оксиантрахинонов. При встряхивании бензольного слоя с раствором аммиака вновь проис­ходит образование фенолятов антрахинонов и они переходят в ам- "миачный слой. Феноляты оксиантрахинонов имеют яркий вишнево- красный, пурпурный или фиолетовый цвет в зависимости от поло­жения оксигрупп.

2. Сублимация антраценпроизводных. На дно сухой пробирки помещают 0,2 г измельченного растительного материала и осто­рожно нагревают, держа пробирку почти горизонтально. Темпе­ратура сублимации 210 °С, время сублимации 10 мин.

Сублимат конденсируется на холодных участках пробирки в виде желтых капель или желтых игольчатых кристаллов. После остывания пробирки к сублимату прибавляют 1 каплю 5%-ного NaOH в этиловом спирте; появляется яркое красное или фиолето­вое окрашивание в зависимости от состава антраценпроизводных (образование фенолятов). Сущность реакции: содержащиеся в ра­стительном материале антрагликозиды при высокой температуре расщепляются с образованием свободных агликонов; одновременно производные антрона и антранола окисляются до антрахинонов, которые возгоняются.

Таблица 1

Методики хроматографического определения. При анализе ле­карственного растительного сырья, содержащего антраценпроиз­водные, используется хроматография на бумаге и в тонком слое сорбента.

При исследовании состава антрагликозидов готовят водные извлечения; при анализе состава агликонов сырье экстраги­руют бензолом, этиловым или метиловым спиртом, которые при нагревании более или менее удовлетворительно экстрагируют как свободные антраценпроизводные, так и их гликозидные формы.

0,3 г измельченного растительного материала нагревают с 3 мл этилового спирта в течение 5 мин, доводя до слабого кипения. После остывания фильтруют. 0,1 мл фильтрата наносят на линию старта и хроматографируют в системе этилацетат — метиловый спирт — вода (100 : 17 : 13) на пластинках «Силуфол». Время хроматогра- фирования 30—40 мин. Хроматограмму высушивают на воздухе, обрабатывают 5%-ным NaOH в этиловом спирте и рассматривают при дневном свете и УФ свете до и после обработки. Одновременно хроматографируют стандарт «свидетель», нанося его раствор рядом с исследуемым извлечением. По величине R_f, характеру окраски и флуоресценции пятен идентифицируют антраценпроизводные ис­следуемого сырья (рис. 14—19). В табл. 1 даны пояснения к рисун­кам.

О

о'о'оооооо оо

|CD0 оо оо О оо

J^O, <*> N <0 ^ ^ ^^

Методики хроматографического определения. При анализе ле­карственного растительного сырья, содержащего антраценпроиз- водные, используется хроматография на бумаге и в тонком слое сорбента.

При исследовании состава антрагликозидов готовят водные извлечения; при анализе состава агликонов сырье экстраги­руют бензолом, этиловым или метиловым спиртом, которые при нагревании более или менее удовлетворительно экстрагируют как свободные антраценпроизводные, так и их гликозидные формы.

0,3 г измельченного растительного материала нагревают с 3 мл этилового спирта в течение 5 мин, доводя до слабого кипения. После остывания фильтруют. 0,1 мл фильтрата наносят на линию старта и хроматографируют в системе этилацетат — метиловый спирт — вода (100 : 17 : 13) на пластинках «Силуфол». Время хроматогра- фирования 30—40 мин. Хроматограмму высушивают на воздухе, обрабатывают 5%-ным NaOH в этиловом спирте и рассматривают при дневном свете и УФ свете до и после обработки. Одновременно хроматографируют стандарт «свидетель», нанося его раствор рядом с исследуемым извлечением. По величине R_f, характеру окраски и флуоресценции пятен идентифицируют антраценпроизводные ис­следуемого сырья (рис. 14—19). В табл. 1 даны пояснения к рисун­кам.

ри исследовании антрагликозидов хроматографирование ведут стеме этилацетат — муравьиная кислота — вода (10 : 2 : 3); из свободных антраценпроизводных ведут в толуоле (хромато- ия на бумаге).

А — этанольное извлечение корней и корневищ марены красильной; Б — рубери- триновая кислота; В — лу- цидинпримверозид; Г — али- аарнн

Рис. 19. Схема хромато- граммы антраценпроиз­водных кассии остроли­стной:

А — этанольное извлечение из листьев кассии остро­листной; Б — реин

§ 5. Количественное определение

Большинство методов количественного определения антра- производных предусматривает определение суммы свободных иантрахинонов после предварительного гидролиза антраглико- ов.

В настоящее время наиболее широко применяется колориметри- кий метод, предложенный Аутергофом, в различных модифика- х. Метод принят ГФ X для определения антраценпроизводных екарственном растительном сырье. Метод ГФ X с некоторыми мнениями (в целях безопасности работы этиловый эфир заме- [ хлороформом) приводится ниже.

Методика количественного определения суммы антраценпроиз- ных (свободных и связанных в виде гликозидов). 0,05 г (точная 1еска) порошка исследуемого сырья помещают в круглодонную колбу с нормальным шлифом вместимостью 100 мл, соединяют с обратным холодильником и подвергают гидролизу путем кипяче­ния в течение 15 мин с 7,5 мл ледяной уксусной кислоты (при иссле­довании коры крушины ольховидной, корня ревеня) или с 7,5 мл ледяной уксусной кислоты и 1 мл концентрированной НС1 (при исследовании листьев сенны, корневища и корня марены). Во время нагревания колбу слегка покачивают, чтобы не допустить приго- рания растительного материала. После остывания в колбу, не сни­мая холодильника, прибавляют 30 мл хлороформа и кипятят на водяной бане в течение 15 мин для экстрагирования свободных антраценпроизводных. После остывания (колбу вместе с холо­дильником снять с водяной бани) хлороформное извлечение фильт­руют через вату в делительную воронку вместимостью 300 мл. Колбу дважды ополаскивают хлороформом (по 10 мл) и, пропуская через эту же вату, выливают в делительную воронку; вату дважды промывают хлороформом (по 5 мл).

К хлороформному извлечению в делительной воронке прибав­ляют 40 мл воды и, слегка покачивая воронку, добиваются пере­мешивания слоев жидкости, чтобы отмыть избыток кислоты. После полного расслоения нижний, хлороформный, слой сливаю?" в ко­ническую колбу вместимостью 250 мл, а водный слой отбрасывают. Из колбы хлороформное извлечение вновь переносят в делитель­ную воронку и приливают туда щелочно-аммиачного раствора (5%-ного NaOH, содержащего 2%-ный аммиак), предварительно ополоснув им колбу. Покачивая делительную воронку в виде «8», добиваются тщательного перемешивания слоев жидкости, чтобы извлечь антраценпроизводные щелочно-аммиачным раствором из хлороформа. Через 5 мин делительную воронку оставляют в покое, и после полного расслоения жидкости сливают нижний, хлороформ­ный, слой в коническую колбу; красный или фиолетовый, прозрач­ный водно-щелочной слой сливают в мерную колбу вместимостью 250 мл. Хлороформный слой вновь переносят в делительную во­ронку, приливают туда 20 мл щелочно-аммиачного раствора, пред­варительно ополоснув им колбу, и вновь извлекают антраценпроиз­водные, как описано выше, до тех пор, пока водно-щелочной слой перестанет окрашиваться.

Собранные водно-щелочные извлечения доводят в мерной колбе до метки щелочно-аммиачным раствором и перемешивают. 25 мл полученного окрашенного раствора помещают в круглодонную колбу с нормальным шлифом, соединяют с обратным холодильни­ком и нагревают на кипящей водяной бане в течение 15 мин. После остывания измеряют оптическую плотность раствора на фотоэлектро- колориметре с зеленым светофильтром (А, = 525 нм) в кювете тол­щиной слоя 10 мм (нулевую точку устанавливают по дистиллиро­ванной воде). При получении слишком интенсивной окраски рас­твор перед колориметрированием разбавляют щелочно-аммиачным раствором.

Концентрацию антраценпроизводных в колориметрическом рас­творе, выраженную в истизине, определяют по калибровочному афику, построенному по хлориду кобальта (СоС1₂-6Н₂0). Для >го готовят от 0,2 до 3,0%-ные растворы хлорида кобальта (10— растворов равномерно возрастающей концентрации) и измеряют оптическую плотность на этом же фотоэлектроколориметре (ка- бровочный график студенты получают готовым). По оси ординат кладывают значение оптической плотности, а оси абсцисс — нцентрацию антраценпроизводных в миллиграммах на 100 мл, ходя из того, что 1 %-ный хлорид кобальта по оптической плот- сти соответствует 0,36 мг истизина в 100 мл щелочно-аммиачного створа. Приготовление эталонных растворов и определение их тической плотности производят не менее 3 раз. Процентное содержание антраценпроизводных в пересчете на солютно сухое сырье вычисляют по формуле

аУК

^Х тЮ (100 — ш) '

е а — концентрация антраценпроизводных в мг на 100 мл, най- нная по калибровочному графику; V — первоначальный объем елочного извлечения, мл; т — масса навески сырья, г; w — по­ря в массе сырья при высушивании, %; К — коэффициент разбав- ния раствора перед колориметрированием. Методика количественного определения антрагликозидов. Около 5 г (точная навеска) измельченного сырья помещают в колбу fecTiiMOCTbK) 150 мл, приливают 100 мл воды, перемешивают 10 мин нагревают с обратным холодильником в кипящей водяной бане течение 15 мин при периодическом перемешивании (покачивании), осле охлаждения под струей воды смесь перемешивают, дают 'стоиться 10 мин и фильтруют через бумажный складчатый фильтр, i мл полученного извлечения помещают в колбу вместимостью Ю мл, прибавляют 2,5 мл 50%-ной H₂S0₄ и нагревают в кипящей >дяной бане при периодическом перемешивании в течение 30 мин. осле охлаждения раствор переносят в делительную воронку вме- гимостью 300 мл, а колбу ополаскивают 10 мл воды и 60 мл хлоро- эрма. Промывные воды и хлороформ присоединяют к основному звлёчению в делительной воронке и- взбалтывают в течение 5 мин. осле отстаивания хлороформный слой отделяют, а извлечение )балтывают с новой порцией (30 мл) хлороформа. К объединенному чороформному извлечению прибавляют 50 мл щелочно-аммиач- эго раствора и осторожно взбалтывают в течение 5 мин. После гстаивания прозрачный водный слой сливают в мерную колбу яестимостью 100 мл, доводят щелочно-аммиачным раствором до етки и перемешивают. 25 мл полученного раствора помещают коническую колбу с обратным холодильником и нагревают в кипя- 1ей водяной бане в течение 15 мин. После охлаждения жидкость оличественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл и оводят объем щелочно-аммиачным раствором до метки.

Оптическую плотность раствора измеряют с помощью спектро- отометра при X = 525 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм, исполь- уя в качестве раствора сравнения щелочно-аммиачный раствор.

Концентрацию производных антрацена в растворе, выражен­ную в хризофановой кислоте, определяют по калибровочному гра­фику, построенному по растворам хлорида кобальта. Процентное содержание антраценпроизводных (в пересчете на антрагликозиды) х вычисляют по формуле

_ аЮО-100-50-100-100-1,59 _ а8-1,59 ^Х~ 1000- 1000/П25 ■ 25 (100 — w) ~m(100 — w) '

где а — концентрация антраценпроизводных испытуемого раство­ра, найденная по калибровочному графику, мг/л; т — масса на­вески сырья, г; до — потеря в массе сырья при высушивании, %; 1,59 — отношение средней массы антрагликозидов к средней массе агликонов.

Для определения отдельных соединений антраценпроизводных пользуются хроматоспектрофотометрическими методами. Из расти­тельного материала антраценпроизводные экстрагируют в виде гликозидов или свободных агликонов и разделяют с помощью хроматографии на бумаге или в тонком слое силикагеля. Для раз­деления антраценпроизводных, извлекаемых метиловым спиртом (антрагликозиды и свободные агликоны), предложен метод тонко­слойной хроматографии на силикагеле марки КСК в системе раство­рителей бензол — метиловый спирт (4 : 1). Пятна антраценпроиз­водных на хроматограмме отмечают в УФ свете и собирают каждое пятно на стеклянный фильтр № 4. Фильтр промывают 0,5 н. NaOH, количественно переносят в мерные колбы емкостью 50 мл и дово­дят объем до метки 0,5 н. NaOH. Через 20 мин определяют оптиче­скую плотность растворов по максимуму поглощения в УФ области.

Реактивы и оборудование: хлороформ; толуол; метиловый спирт (метанол); этиловый спирт (этанол); этилацетат; бензол; муравьиная кис­лота; уксусная кислота (лед.); НС1 (конц. и 10%-ная); H₂S0₄ (50%-ная); NaOH (0,5 н. и 10%-ный); NaOH (5%-ный в этиловом спирте); аммиак (10%-ный); ще- лочно-аммиачный раствор (NaOH 5%-ный, содержащий 2%-ный аммиак); ко­бальта хлорид; магния ацетат (1%-ный раствор в этиловом спирте).

Пластинки «Силуфол».

Хроматографическая бумага «С»; фотоэлектроколориметр; спектрофотометр; УФ лампа; колбы конические вместимостью 50, 100, 250 мл; колбы круглодонные с нормальным шлифом вместимостью 50, 100 мл; колбы мерные вместимостью 25, 50, 100, 250 мл; воронки делительные вместимостью 100, 250, 300 мл, холодиль­ники (обратные) стеклянные лабораторные с нормальным шлифом; камеры хрома- тографические для ТСХ; камеры хроматографические для БХ; пробирки стек­лянные; штативы для делительных воронок; фильтры стеклянные № 4, воронки стеклянные для фильтрования диаметром 5 см; штативы лабораторные, плитки электрические; бани водяные лабораторные; весы лабораторные аналитические.

Вопросы для подготовки

1. Какие природные вещества называют антраценпроизводными?

2. Что лежит в основе классификации антраценпроизводных, на какие груп­пы их разделяют?

3. В каком виде антраценпроизводные находятся в растении?

4. Какими реакциями можно открыть антраценпроизводные в раститель­ном сырье?

5. Что происходит с антраценпроизводными и их гликозидами при нагре­вании растительного сырья?

6. Чем обусловлена растворимость свободных антраценпроизводных в вод» [X растворах щелочи?

7. Какое свойство антраценпроизводных можно использовать для установ- ния их локализации в тканях растения?

8. Какими физико-химическими свойствами характеризуются свободные траценпроизводные и их гликозиды?

9. В чем сущность метода количественного определения антраценпроиз- дных в лекарственном растительном сырье?

10. Какие реакции можно использовать для проявления антраценпроизвод-IXна хроматограммах?

Литература

Георгиевский В. П., Казаринов Н. А., Каррыев М. О. Физико-химические тоды анализа биологически активных веществ растительного происхожде- [я. — Ашхабад: Ылым, 1976.