Робота 25

Виявлення дихальних ензимів у рослинних об’єктах

Реакції дихання за своєю природою є ензиматичними. Ензими, що залучені в окисно-відновні реакції дихання можна розділити на три групи: І дегідрогенази (дегідроаскорбатоксидаза); ІІ оксидази (цитохромоксидаза, поліфенолоксидаза, ксантиноксидаза); ІІІ ензими – проміжні переносники електронів (цитохроми). Дегідрогенази – двокомпонентні ензими, які здійснюють дегідрування дихального субстрату, бувають аеробного і анаеробного типу. Акцептором водню від анаеробних дегідрогеназ є ензими проміжного перенесення електронів (водню) дихальним ланцюгом і аеробні дегідрогенази. Акцептором водню від аеробних дегідрогеназ є кисень, хінони і термінальні цитохроми дихального ланцюга.

Прилади і матеріали дослідження:водяна баня, газовий пальник або спиртівка чашки Петрі, пінцет, здорові бульби картоплі, яблуко, цвітна капуста, 3% і 0,1% розчини H₂O₂, 0,5% водний розчин трифенілтетразолію хлориду (ТТХ).

Хід виконання роботи

Шкірку картоплини розрізають на тоненькі смужки з вічками; для кожного варіанта готують по дві смужки – дослід і контроль. Контрольну смужку за допомогою пінцета занурюють на 5 хвилин у киплячу воду (щоб інактивувати ензими), після чого обидві смужки поміщають у чашки Петрі.

1. Оксидази. Смужки заливають свіжо приготованим 2%-ним спиртовим розчином гваяколу і через 15 хвилин на дослідному фрагменті виявляють блакитне забарвлення, зумовлене окисненням гваяколу.

2. Пероксидази. Як і у попередньому досліді, на смужки шкірки картоплини спершу наливають розчин гваяколу, який згодом заміщують на 0,1%-ний H₂O₂. Якщо блакитне забарвлення з’являється швидше, ніж у випадку виявлення оксидаз, то це свідчить про наявність пероксидази.

3. Каталаза. Шкірки картоплини заливають 3%-ним розчином Н₂O₂, якщо над дослідною смужкою з’являється піна (внаслідок виділення кисню), то це свідчить про активність каталази.

2Н₂О₂ 2Н₂О + О₂

4. Дегідрогенази. Дослідну смужку, обробляють 0,5%-ним ТТХ. За наявності дегідрогеназ шкірка протягом 15-ти хвилин забарвлюється у червоний колір: ензими відновлюють тетразол до червоного формазану.

5.“Дихальні хромогени”. Дослідна смужка (жива) стає брунатною на повітрі внаслідок окиснення ароматичних амінокислот (наприклад, тирозину). Реакція відбувається за участю Cu-вмісної тирозинази; темне забарвлення зумовлене утворенням попередників меланіну.

6. Поліфенолоксидази. Свіжозрізаний шматок цвітної капусти у кількох місцях дотикають до гарячого предмета, намащують розвареною масою з яблука і додають кілька крапель Н₂O₂. На не нагрітих ділянках через кілька хвилин з’являється брунатне забарвлення. Внаслідок варіння в тканині яблука руйнуються поліфенолоксидази, тоді як тирозин і поліфеноли зберігаються. Водночас, тканина капусти містить поліфенолоксидази, але не має відповідного субстрату. Після нагрівання відбувається локальне знищення ензиму, на інших ділянках внаслідок реакції субстрату яблука і ензиму із капусти з’являється забарвлення.

7.Висновки.