Оптическое детектирование одиночных молекул

Спектроскопия и химия единичных молекул

Конец ХХ века (и второго тысячелетия) химия отметила сразу двумя замечательными результатами крупного, стратегического значения.

Во-первых, осуществилось желание химиков видеть, визуализировать главное событие - химическую реакцию, и представить "развёртку" этого события во времени (фемтохимия).

Во-вторых, химия вышла на необыкновенный рубеж - детектирование единичной молекулы и её физического и химического поведения. Химия достигла такого совершенства, когда её главный предмет - молекула приобрела индивидуальность, стала "личностью". Оба результата символизируют высшие горизонты современной химии - предельное разрешение во времени и в пространстве.

Оптическое детектирование одиночных молекул

Прогресс в технике фотодетекторов и сканирующих оптических микроскопов открыл доступ к наблюдению одиночных молекул (типа родамина-6Ж и террилендиимина). Возбуждая постоянным облучением и наблюдая во времени стационарную люминесценцию одиночных молекул (молекулярных "светлячков"), можно исследовать латеральную диффузию молекул на твёрдых поверхностях и объёмную диффузию в твёрдых телах (типа полимеров). Используя поляризованный свет для возбуждения и детектируя поляризованную люминесценцию, можно измерять реориентацию молекул и осуществлять мониторинг их траекторий. Уже обнаружены первые удивительные явления. Так, оказалось, что молекулы родамина-6Ж на стекле ведут себя причудливым образом: некоторые из них неподвижны, другие перемещаются не вращаясь, третьи вращаются не перемещаясь. Ещё интереснее поведение террилендиимина на поверхности SiO₂: люминесценция некоторых молекул оказалась дважды модулированной низкой частотой (10Гц и 100 Гц), причём у "модулированных" молекул полосы люминесценции имеют голубой сдвиг. Зондирование поверхностей молекулярными "светлячками" обещает много новых открытий.

Возможности оптики одиночных молекул не ограничиваются только молекулярной динамикой. Обнаруживается "мерцающее", нестатистическое поведение одиночных молекул, связанное со спектральной диффузией; возможно также прямое измерение скорости передачи энергии на соседние молекулы и зависимости её от расстояния (которое регулируется путём изменения числа "светлячков" на единицу поверхности; обычно размещается несколько молекул на квадратный микрон).

Ещё более продвинутая техника использовалась для наблюдения за флуоресценцией одиночных липидных молекул и их движением в мембране. Достоинство этой техники в том, что метка-флюорофор возбуждалась двухфотонным поглощением инфракрасного излучения фемтосекундного лазера; это резко снизило шумовой оптический фон в видимой области флуоресценции и повысило чувствительность техники; а это открыло новые горизонты в исследовании клеточных мембран на уровне единичных молекул.

Спектроскопия одиночных молекул активно вторгается в исследования единичного фотосинтезирующего комплекса и ансамбля пигментов - светособирающей антенны; она позволяет визуализировать взаимодействие между единичной фаговой ДНК и липосомой. Она информирует, на каком пигменте "cидит" энергия, с какой вероятностью она передаётся, как расположены пигменты и т.д.

Возможности оптики одиночных молекул масштабно расширяет импульсная оптическая спектроскопия. Она позволяет одновременно регистрировать интенсивность флуоресценции, поляризацию и время жизни, частоту вращения молекул и анизотропию вращательной диффузии; она использована уже для молекул с низким молекулярным весом в жидкостях и для макромолекул (включая Зелёный флуоресцирующий протеин, который сейчас привлекает широкое внимание в молекулярной биологии как клеточная молекула-репортёр).

Импульсная спектроскопия предлагает новые возможности в исследованиях в прямом измерении квантового выхода распада единичных молекул. Например, для единичных молекул тетраметилродамина, присоединённых химически к участку 217-вр ДНК, были измерены "возраст смерти" (число фотонов, излучённых молекулой до момента её гибели) и время выживания (время, которое единичная, избранная молекула живёт и излучает). Гистограммы "возраста смерти" и времени выживания, построенные для 102 молекул (каждая из них наблюдалась изолированно, в одиночестве), описывается экспоненциальной функцией. Именно на этом пути лежит экспериментальное тестирование проблемы эргодичности.