Лекция по клинической биохимии «Биохимия воспаления.

Биохимия аутоиммунных заболеваний»

Развитие воспалительного процесса связано с синтезом, секрецией и реализацией биологических эффектов ряда медиаторов. Медиаторывоспаления классифицируют по химической структуре (биогенные амины, полипептиды, белки, производные арахидоновой кислоты), по происхождению (гуморальные, клеточные), по эффектам (нецитотоксического и цитотоксического действия), по скорости развития эффектов (немедленного и замедленного типа действия).

Основными группами медиаторов воспаления являются биогенные амины (гистамин, серотонин), плазменные протеолитические системы (кинины, факторы свертывания и антикоагулянты, компоненты системы комплемента), производные арахидоновой кислоты, килородные радикалы и гидроперекиси липидов, цитокины.

Гистамин синтезируется из гистидина под действием фермента гистидиндекарбоксилазы, депонируется в тучных клетках, базофилах, тромбоцитах. После высвобождения быстро разрушается гистаминазой эозинофилов. Либераторами гистамина являются термические агенты, бактериальные токсины, протеазы, антигены, вазимодействующие с IgЕ, С3- и С5-фракции комплемента, катионные белки лейкоцитов.

Серотонин является производным триптофана, образующимся при декарбоксилировании. Разрушается аминоксидазами с образованием 5-оксииндолуксусной кислоты, выводящейся из организма. Серотонин содерджится в нейронах мозга, энтерохромаффинных клетках ЖКТ, тучных клетках, базофилах, тромбоцитах. Секреция серотонина происходит под деййствием комплексов антген-антитело, ФАТ, коллагена, тромбина, АТФ.

Кининыобразуются в крови и тканях из a2-глобулина плазмы (кининогена), расщепление которого происходит под действием калликреинов (плазменного и тканевого). Оба фермента в обычно состоянии не активны и существуют в качестве калликреиногенов, активируемых фактором Хагемана. Калликреины сами могут активировать фактор Хагемана, обладают хемотаксической активностью, вызывают агрегацию форменных элементов крови. Активаторами системы кининов в тканях могут быть гистамин, протеазы, катионные белки лейкоцитов. В крови и тканях кинины быстро расщепляются кининазами, содержащимися во многих клетках, а также инактивируются a1-антитрипсином, ингибитором С-фракции комплемента.

Комплемент представляет собой плазменную систему, включающую не менее 18 белков. Он является неспецифическим механизмом, обеспечивающим лизис чужеродных и собственных измененных клеток. Классический путь активации комплемента включается антителами G и M, С-реактивным белком, онкогенными РНК-содержащими вирусами. Этот путь представляет собой каскад ферментативных реакций, в результате которых на каждом этапе образуются физиологически активные фрагменты комплемента. Альтернативный путь активируется ЛПС бактерий, плазмином, тромбином, калликреином, протеазами бактерий и собственных клеток, но при этом нобходимо участие специфических плазменных факторов, из которых наиболее важным является пропердин. Считается, что альтернативный путь активации комплемента может включаться также иммуноглобулинами A, D, E. Каждый активированный фрагмент комплемента имеет соответствующий ферментный инактиватор, вследствие чего система в случае необходимости может вернуться в обычное состояние.

Эйкозаноиды образуются в очаге воспаления в результате активации фосфолипаз при повреждении мембран клеток и высвобождения арахидоновой кислоты, являющейся объектом ферментативной активности циклооксигеназы и липооксигеназы. Кроме того, существует неэнзиматическая пероксидация арахидоновой кислоты свободными радикалами кислорода, в результате чего образуются активные липидные гидроперекиси с хемотаксической активностью.

В очаге воспаления значительно активизируются свободнорадикальные процессы вследствие активной гиперемии и повышения доставки кислорода в ткани. Важным источником свободных радикалов являются активированные нейтрофилы и макрофаги (респираторный взрыв). Свободные радикалы ответственны за повреждение клеток, уничтожение чужеродных клеток, модуляцию активности медиаторов воспаления. Так, свободные радикалы инактивируют a1-антитрипсин, повышая тем самым протеолитическую активность плазмы крови и способствуя образованию кининов. При остром воспалении свободные радикалы вызывают разрушение межклеточного матрикса, но также могут стимулировать синтез его компонентов, повреждают фибробласты, но одновременно стимулируют их пролиферацию и дифференцировку.

Цитокины в значительном количестве продуцируются в очаге воспаления, в частности, ФАТ, факторы хемотаксиса, ИЛ, ИНФ, ФНО. Кроме того, в очаге воспаления концентрируется много катионных белков, гидролитических ферментов (эластаза, коллагеназа, катепсины, протеазы с кининогенной активностью).

Значение медиаторов заключается в обеспечении связи между отдельными клетками-участниками воспаления, потенцировании или ингибировании эффектов друг друга, участии в межклеточной коммуникации и регуляции пролиферации, дифференцировки, запрограммированной гибели клеток в очаге воспаления, реализации острофазового ответа организма, проявлении определенной “тканеспецифичности” воспалительной реакции, управлении ходом воспаления.

На всех этапах развития воспаления высвобождаются и начинают действовать вещества, которые предупреждают избыточные эффекты медиаторов. Это так называемая система антимедиаторов воспаления. Соотношение медиаторов и антимедиаторов воспаления во многом определяет особенности формирования, развития и затухания воспалительного процесса.

К антимедиаторам воспаления относятся ферменты - гистаминаза, разрушающая гистамин, карбоксипептидазы, разрушающие кинины, эстеразы, ингибирующие фракции комплемента, простагландиндегидрогеназы, разрушающие простагландины, арилсульфатаза, разрушающая лейкотриены, СОД и каталаза, инактивирующие свободные радикалы. Кроме того, к антимедиаторам воспаления относятся ингибиторы протеаз - a1-антитрипсин (синтезируется в гепатоцитах), являющийся ингибитором протеаз (трипсина, хемотрипсина, плазмина, тромбина, калликреина), a2-макроглобулин и интер-a-трипсин-ингибитор. Эти белки синтезируются в рамках острофазового ответа и представляют собой ответную реакцию организма на формирование очага воспаления.

В настоящее время ключевой в развитии воспаления представляется роль эндотелиоцитов и биологически активных веществ, продуцируемых ими. Кроме того, большинство «классических» вазодилятаторов, концентрация которых велика в зоне воспаления, действуют опосредованно, стимулируя эндотелиальные клетки к продукции медиаторов, обладающих вазодилятаторной активностью (простациклин и оксид азота). Простациклин образуется при стимуляции эндотелиальных клеток тромбином, гистамином, лейкотриеном С4, ИЛ-1, ФНО. Оксид азота продуцируется в стимулированных эндотелиоцитах, имеющих повышенный уровень кальция в цитоплазме. С другой стороны, эндотелиоциты синтезируют вещества с вазоконстрикторным действием, в частности, эндотелин-1, фактор роста тромбоцитов, ФАТ. Все цитокины действуют по паракринному и аутокринному механизмам, вызывая структурную реорганизацию цитоскелета эндотелиальных клеток, что повышает проницаемость сосудов.

Биохимия межклеточных взаимодействий в очаге воспаления, в частности, между эндотелиоцитами и лейкоцитами, достаточно хорошо изучена. Так, установлено, что такие взаимодействия опосредуются преимущественно молекулами клеточной адгезии (интегринами, иммуноглобулинами, селектинами). Интегрины и селектины лейкоцитов обеспечивают адгезию циркулирующих клеток к эндотелию, а селектины и члены суперсемейства иммуноглобулинов на эндотелии служат лигандами для лейкоцитарных рецепторов. Нейтрофилы постоянно экспрессируют на своей поверхности адгезивные молекулы, число и функциональный статус которых быстро изменяются в ответ на действие специфических стимулов, в частности, это b2-интегрины и L-селектин. Врожденный дефицит экспрессии интегринов, возникший в результате мутации гена, кодирующего этот белок, заметно снижает аккумуляцию нейтрофилов в местах попадания инфекционного агенты или заживления раны.

Воспаление является очень динамичным процессом, уже спустя 4 часа после его начала в воспалительном инфильтрате и сосудистом русле начинаются изменени: уменьшается число нейтрофилов и возрастает число мононуклеарных лейкоцитов (моноцитов и лимфоцитов). Эти изменения коррелируют со сменой фенотипа адгезивных молекул на эндотелиальных клетках. Например, через 6-8 часов после действия воспалительных цитокинов экспрессия селектина уменьшается, но увеличивается синтез молекул межклеточной адгезии ICAM-1. Эти и другие события определяют смену фаз воспаления, реорганизацию эндотелия, миграцию и активацию лейкоцитов. Цитокины, продуцируемые этими клетками (лейкоцитами и эндотелиоцитами) изменяют протеазно/антипротеазный баланс, что приводит к повреждению белков базальной мембраны. Кроме того, активированные эндотелиальные клетки синтезируют большое количество гликозаминогликанов (гиалуроновая кислота, хондроитинсульфат, гепаринсульфат, гепарин), которые поддерживают заряд базальной мембраны.

В периоде репарации (стадия пролиферации) происходит интенсивный синтез коллагенов, что стимулируется ТФР, ИЛ, в то время как ИФН блокирует экспрессию гена коллагена и выступает, вероятно, в роли эндогенного медиатора, завершающего накопление коллагена в зоне повреждения. При индукции ТФР синтеза компонентов внеклеточного матрикса в зоне повреждения появляется значительное количество фибронектина и протеогликанов (гликозаминогликанов, связанных с белками, например, бигликана и декорина). Кроме того, появляются компоненты внеклеточного матрикса, которые отсутствуют в нормальной ткани, например, тенасцин, одна из изоформ фибронектина. При миграции в зону репарации моноцитов и макрофагов происходит дополнительная продукция ТФР, который блокирует процесс деградации внеклеточного матрикса путем снижения синтеза протеаз. ТФР усиливает экспрессию интегринов, что способствует репарации поврежденной ткани. При несбалансированной продукции ТФР этот процесс может стать патологическим, приводя к развитию фиброза или рубца. В норме спустя определенное время экспрессия гена ТФР в клетках очага повреждения блокируется, уменьшается синтез компонентов внеклеточного матрикса и начинается процесс их деградации.

Разрушение матрикса начинается с ферментативного или физического повреждения (например, свободными радикалами) с последующим эндоцитозом поврежденных компонентов и перевариванием их лизосомными протеазами (катепсинами). Матриксные металлопротеиназыиграют важную роль, так как они секретируются клетками in situ, способны катаболизировать все основные компоненты матрикса. Синтез и секреция металлопротеиназ и тканевых ингибиторов металлопротеиназ регулируются некоторыми факторами роста, гормонами, ИЛ-1, ФНО. Кроме того, регулируемым является этап активации металлопротеиназ (превращение проферментов в активную форму с вовлечением свободного цинка в интрамолекулярный протеолитический процесс).

При ненормальной экспрессии некоторых молекул адгезии, дисбалансе продукции цитокинов, нарушении процессов апоптоза клеток, нарушении продукции медиаторов и антимедиаторов воспаления возможно развитие аутоиммунизации и хронизации воспалительного процесса.

Клетки эндотелия участвуют в реализации механизма свертывания крови, отграничивающего очаг воспаления, за счет секреции ряда цитокинов и экспрессии молекул адгезии и рецепторов, необходимых для адгезии нейтрофилов и моноцитов (Mac-1, LFA-1). Локализация и концентрация на активированных моноцитах фибриногена и фактора X – субстратов специфических протеаз крови, ведет к запуску внутреннего и внешнего механизма свертывания. Важную роль в этих процессах играет фактор активации тромбоцитов (ФАТ), синтезируемый эндотелиоцитами, и вызывающий лейкопению вследствие агрегации клеток, хемотаксиса, диапедеза и инфильтрации стенки сосуда, сладж-феномен в сосудах микроциркуляции, транссудацию плазмы с последующим интерстициальным отеком, адгезию нейтрофилов к эндотелию. Образование ФАТ стимулируется тромбином, ИЛ-1 и ФНО, что может быть одним из механизмов хронизации воспаления: в очень низкой концентрации ФАТ стимулирует макрофаги к синтезу ИЛ-1 и ФНО, что стимулирует дополнительную пролиферацию клеток, деструкцию тканей и дальнейшую продукцию ФАТ.

С другой стороны, естественные механизмы ограничения тромбообразования включают инактивацию тромбина и активных факторов свертывания плазменными ингибиторами протеиназ в жидкой фазе и на поверхности эндотелия сосудов, инактивацию тромбина тромбомодулином эндотелия и блокирование образования тромбина системой протеина С, освобождение гепарина, синтезируемого и депонируемого тучными клетками, и гепариноподобных гликозаминогликанов, вырабатываемых эндотелием, освобождение эндотелием тканевого активатора плазминогена и антиагрегационных простагландинов. Прямая инактивация тромбина и других протеаз крови осуществляется семейством серпинов (ингибиторы сериновых протеаз), включающих a1-антитрипсин, антитромбин III, антихимотрипсин, ингибтор протеина С, a2-антиплазмин, a2-макроглобулин. В большинстве случаев ингибирование протеиназ характеризуется образованием необратимых комплексов между реактивным участком ингибитора и активным центром протеиназы. Все серпины состоят из одной полипептидной цепи, которая имеет напряженную («стрессированную») конформацию до образования комплекса с протеазой, после гидролиза пептидной связи происходят значительные изменения конформации серпина, его релаксаци. В такой форме серпины взаимодействуют с рецепторами гепатоцитов, осуществляющих клиренс комплексов «ингибитор-протеаза». Такой механизм регуляции нарушается вследствие повреждения серпинов, вызванного их протеолизом или окислением.

Таким образом, важным компонентом воспаления является ответ острой фазы, обусловленный локальной продукцией цитокинов, с кровотоком доставляемых в печень, их стимулирующим действием на гепатоциты, в результате чего изменяется спектр некоторых белков и пептидов, продуцируемых этими клетками «на экспорт».

Содержание некоторых белов при воспалении уменьшается(альбумин, трансферрин), других – увеличивается (фибриноген, протромбин, плазминоген, фактор VIII, компоненты комплемента, ингибиторы протеолитических систем (a1-антитрипсин, a1-антихимотрипсин), гаптоглобин, ферритин, гемопексин, церулоплазмин, неспецифический опсонизирующий агент – С-реактивный белок).

Свое название С-реактивный белок получил из-за способности преципитировать С-полисахарид клеточной стенки пневмококка. СБ усиливает подвижность лейкоцитов, влияет на функциональную активность Т-лимфоцитов, инициируя реакции преципитации, агглютинации, фагоцитоза и связывания комплемента. Повышение СРБ в крови начинается через 14-24 часов с момента начала воспаления и исчезает в ходе реконвалесенции. СРБ синтезируется в печени и состоит из 5 кольцевых субъединиц. Уровень СРБ отражает интенсивность воспалительного или некротического процесса. Кроме того, повышение уровня СРБ в крови наблюдается при опухолях, инфекциях, диффузных болезнях соединительной ткани, туберкулезе, инфаркте миокарда, состояниях после тяжелых операций.

Существуют острофазовые белки, функция которых неизвестна, в частности, орозомукоид, сывороточный компонент амилоида, G-глобулин. Синтез всех белков острой фазы является целесообразным для организма, коль скоро он обеспечивает регуляцию локальных процессов в очаге воспаления (предупреждение распространения повреждения, предотвращение избыточной активации механизмов деградации биомакромолекул, контроль окислительного стресса) и является связующим звеном между местными и общими реакциями организма при воспалении.

Одной из разновидностей воспалительного процесса являются аутоиммунные процессы, обусловленные: 1) снижением функции Т-супрессоров; 2) изменением антигенных свойств клеток; 3) поступлением в кровь секвестрированных антигенов; 4) нарушением функциональной активности иммунокомпетентных клеток вследствие мутаций генов, кодирующих белки, участвующие в регуляции иммунного ответа, и срыва иммунологической толерантности.

Диагностическими иммунологическими маркерами аутоиммунных заболеваний соединительной ткани являются антиядерные антитела и антитела к цитоплазматическим антигенам.

Аутоантитела к ДНК и гистонам могут вырабатываться к двухцепочечной или одноцепочечной ДНК. Эти антитела неспецифичны по отношению к определенным заболеваниям, хотя, например, антитела к двухцепочечной ДНК более характерны для СКВ, и их титр связан с прогрессированием этого заболевания. Специфичным для СКВ является обнаружение антител к Sm цитоплазматическому компоненту, однако концентрация этих антител, в отличие от антиядерных антител, не меняется при терапии СКВ. Клинически присутствие Sm-антител связано с более агрессивным течением заболевания, поражением центральной нервной системы, развитием психозов, относительно сохранной функцией почек. Часто при СКВ, РА, склеродермии обнаруживаются антитела к гистонам. Антитела к нуклеосомам появляются значительно раньше, чем к двухцепочечной ДНК и обнаруживаются у 84-88% пациентов с СКВ. Известно, что нуклеосомы состоят из приблизительно 140 пар оснований ДНК, обернутой вокруг ядра из белков-гистонов H2A, H2B, H3 и H4. Гистон H1 взаимодействует с нуклеосомой и в комплексе с ДНК связывает прилегающие нуклеосомы. Комплексы антиядерных антител с нуклеосомами могут связывать гепарансульфат гломерулярной базальной мембраны через гистоновую часть нуклеосомы у пациентов с СКВ. Антинуклеосомные антитела – более чувствительный маркер СКВ, склеродермии, чем антитела к двухцепочечной ДНК.

Антитела к цитоплазматическим компонентам (SS-A, SS-B, RNP-70, RNP/Sm), а также антитела к центромере В и топоизомеразе (Scl-70) являются диагностическими параметрами диффузных болезней соединительной ткани, позволяющими осуществлять дифференциальную диагностику: например, частота нахождения антител к RNP/Sm максимальна при т.н. смешанных заболеваниях соединительной ткани, антител к Scl-70 – при склеродермии, антител к SS-A и SS-B – при синдроме Шегрена.

Антитела к Fc-фрагментам IgG (ревматоидный фактор), обычно являющиеся IgM, характерны для ревматоидного артрита, хотя могут обнаруживаться при синдроме Шегрена, склеродермии, дерматомиозите, В-клеточных лимфопролиферативных заболеваниях.

Антимитохондриальные антитела – гетерогенная группа аутоантител против различных белков, расположенных на внутренней и наружной мембранах митохондрий. Эти антитела имеют диагностическое значение для первичного билиарного цирроза – хронического заболевания печени, протекающего с воспалением и обструкцией внутрипеченочных желчных протоков, циррозом и развитием печеночной недостаточности.

Открытие антител к нейтрофильным цитоплазматическим антигенам (ANCA), высоко специфичных для системных некротизирующих васкулитов, в первую очередь для гранулематоза Вегенера, улучшило диагностику этих заболеваний. Наиболее значимыми являются антитела к ферментам первичных гранул – протеиназе-3 и миелоперокисдазе. В отличие от СРБ, не отмечается заивимости повышения титра ANCA при присоединении инфекционных осложнений, что позволяет осуществлять точную диагностику степени тяжести васкулита.

Антитела к базальной мембране клубочков почек (анти-GBM) непосредственно вызывают развитие гломерулонефрита, в том числе при синдроме Гудпасчера (поражение легких). При этом заболевании титр антител коррелирует с активностью процесса, поэтому их определение используют для мониторинга болезни.

Изучение антифосфолипидных антител началось с разработки Вассерманом серологического метода диагностики сифилиса, было обнаружено, что основным компонентом, с которым реагируют антитела в реакции Вассермана, является отрицательно заряженный фосфолипид кардиолипин. Затем в сыворотке больных СКВ был обнаружен ингибитор свертывания крови, названный волчаночным антикоагулянтом. Впоследствии оказалось, что антикардиолипиновые антитела являются маркером так называемого антифосфолипидного синдрома: венозные и/или артериальные тромбозы, привычное невынашивание беременности, тромбоцитопения, а также другие неврологические, кожные, сердечно-сосудистые и гематологические нарушения. Первичный антифосфолипидный синдром развивается самостоятельно, без присутствия аутоиммунных заболеваний, вторичный – на фоне СКВ. Антифосфолипидные антитела обнаруживаются у 2-4% здоровых людей, чаще у лиц пожилого возраста, частота обнаружения увеличивается у больных с воспалительными, аутоиммунными и инфекционными заболеваниями, злокачественными новообразованиями, на фоне приема лекарственных препаратов (оральные контрацептивы, психотропные средства), после перенесенного инфаркта миокарда или инсульта, при рецидивирующих спонтанных абортах, у 1/3 больных СКВ. Клинические проявления антифосфолипидного синдрома могут имитировать васкулиты, инфекционный эндокардит, опухоли сердца, рассеянный склероз, гепатит, нефрит. Антифосфолипидные антитела представляют собой семейство антител, которые распознают антигенные детерминанты анионных и нейтральных фосфолипидов (кардиолипин, фосфатидилинозитол, фосфатидилсерин, фосфатидная кислота) и комплексные эпитопы, образующиеся в процессе взаимодействия фосфолипидов и фосфолипидсвязывающих белков(аннексин V, протромбин, b2-гликопротеин I (аполипопротеин Н), кининогены).

Антитела к фосфолипидсвязывающим белкам могут выявляться в различных сочетаниях, и их активность тесно связана с процессами тромбообразования: активация тромбоцитов и повреждение эндотелия происходят вследствие связывания аутоантител с белками свертывания на поверхности фосфолипидов. При этом антитела собственно к фосфолипидам мембран тромбоцитов и эндотелия выполняют триггерную функцию при активации и повреждении клеток.

Лабораторная диагностика антифосфолипидного синдрома до недавнего времени была основана на определении волчаночного антикоагулянта в помощью функциональных тестов и антител к кардиолипину с использованием ИФА. Волчаночный антикоагулянт (антитела), связываясь in vitro с фосфолипидами, удлиняет фосфолипид-зависимые тесты коагуляции (например, конверсию протромбина в тромбин). В настоящее время диагностика антифосфолипидного синдрома основана на использовании скрининговых тест-систем для определения антител к различным фосфолипидам, что повышает диагностическую ценность этих исследований.