Особенности культивирования отдельных групп прокариот

Спирохеты

Спирохеты – хемоорганотрофные бактерии, являются аэробными, факультативно анаэробными или анаэробными микроорганизмами.

Медицинское значение имеют представители родов Treponema, Borrelia, Leptospira.

Трепонемы (возбудители сифилиса, фрамбезии и эндемического сифилиса) являются факультативными анаэробами, черезвычайно прихотливы и не растут на искусственных питательных средах, в куриных эмбрионах или на культурах клеток. Те разновидности их штаммов, которые удается выращивать являются, вероятно, сапрофитными трепонемами, близкими к возбудителю сифилиса. Для их культивирования используют МПБ или печеночный бульон с добавлением кусочков печени и яичек кролика. Можно применять бульон из бычьего сердца с тиогликолятом Na или МПБ, дополненный кроличьей, лошадиной сывороткой, асцитической жидкостью, сывороткой человека. Посевы культивируются в анаэробных условиях при 35⁰С, рост появляется на 3-5 сут культивирования. Эти штаммы (культуральные трепонемы) используют при изготовлении антигенов для серодиагностике сифилиса. Единственным способом выращивания патогенных для человека трепонем также является заражение кролика в яичко (экспериментальный орхит).

Боррелии, вызывающие у человека эпидемический возвратный тиф, клещевые боррелиозы, в том числе болезнь Лайма, являются микроаэрофилами, растут при 20-37⁰С, рН – 7,2-7,4 на специальных средах, содержащих кровь, сыворотку, ткани животного происхождения (среды Аристовского-Гельцера, Клиглера-Робертсона), залитых сверху тонким слоем вазелинового масла. Первые генерации боррелий появляются на 4. 7, 14 день выращивания, что обнаруживается при микроскопии мазков. Кроме того, боррелии можно культивировать на хорион-аллантоисной оболочке куриного эмбриона. Боррелии, вызывающие эндемические возвратные тифы, активно размножаются в организме белых мышей и морских свинок, вызывая септицемию.

Лептоспиры (возбудители лептоспироза) являются гидробионтами, а по типу дыхания аэробами. Выращиваются на стерильной дистиллированной воде с добавлением 10% кроличьей сыворотки (среда Уленгута); пептона, поваренной соли и фосфатной буферной смеси (среда Ферворта-Вольфа) или полужидкой агаровой среде с гемолизированной кроличьей кровью. Развиваются медленно, на 5-7 день и позднее при температуре 28-30⁰С. Жидкие питательные среды при этом остаются прозрачными, иногда может быть легкая опалесценция. Рост лептоспир контролируют микроскопируя препарат «висячая» капля в темнопольном или фазово-контрастном микроскопе. В полужидких средах образуются колонии округлой формы диаметром 1-3 мм.

Микоплазмы

Микоплазмы являются хемоорганотрофами, факультативными анаэробами, хотя лучше растут в аэробной среде и только немногие виды - в анаэробных условиях. Они прихотливы к условиям культивирования; в питательные среды необходимо вносить нативную сыворотку, холестерин, нуклеиновые кислоты, витамины, различные соли. Питательные среды могут быть полужидкие, жидкие и плотные, состоящие из 7 частей основной среды (перевар сердечной мышцы крупного рогатого скота), 1 части 25%-ного экстракта свежих дрожжей и 2 частей непрогретой лошадиной сыворотки (среды разработанные В.Д. Тимаковым, Г.Я. Каган). За рубежом широкое использование получили жидкая и плотная питательные среды фирмы Дифко, а также дифференциальная агаровая среда А-7. Оптимальная температура для роста микоплазм в агаровых культурах 36,5-37⁰С, рН – 7,0, при повышении рН до 8 микоплазмы гибнут.

При нанесении капли материала, содержащего микоплазмы, она адсорбируется агаром, образуя уплотнение между его нитями. В результате размножения микоплазм, внутри нитей агара формируется маленькая сферическая колония, которая растет и через 24-28 часов инкубации достигает поверхности водной пленки, в результате образуются две зоны роста - мутный гранулярный центр, врастающий в среду, и плоская ажурная полупросвечивающая периферическая зона (вид «глазуньи»). Спустя 3-5 сут инкубации колонии могут достигать размера 1,5-2 мм, но чаще они так малы, что их трудно увидеть невооруженным глазом и посевы просматривают при малом увеличении микроскопа. Микоплазмы образуют колонии более крупные, чем уреаплазмы (15-60 мкм в диаметре).

На полужидких средах микоплазмы растут по ходу посева уколом, формируя крошковатые колонии, а на жидких питательных средах вызывают опалесценцию или тонкую жирную пленку, а иногда придонный рост.

Патогенные микоплазмы хорошо размножаются в культурах тканей (Hep-2, HeLa), вызывая через 72-86 час резкую дегенерацию клеток – цитопатогенный эффект, сапрофитные виды таким свойствам не обладают. Кроме того, в литературе имеются отдельные сообщения об успешном моделировании экспериментальной уреаплазменной инфекции на обезьянах при интрауретральном инфицировании свежевыделенными штаммами микоплазм человеческого происхождения.

Актиномицеты

Среди актиномицетов встречаются как облигатные, так и факультативные анаэробы. Они способны расти при температуре от 3-7⁰С до 40⁰С, температурный оптимум 35-37⁰С, оптимальная рН от 6,0 до 6,8, для роста требуют СО₂. Цвет и размеры колоний на питательных средах актиномицетов вариабельны и видоспецифичны. Молодые колонии более тонкие, плоские и круглые, легко снимаются с поверхности петлей. Зрелые культуры гладкие или исчерченные, складчатые или бугристые, мягкой восковидной или крошковидной консистенции, прочно спаяны с питательной средой. Поверхность колоний у одних гладкая, у других бархатистая, пушистая или мучнистая, это связано с образованием воздушного мицелия и спор. Пигментация колоний - характерный признак актиномицетов: колонии могут быть фиолетового, синего, красного, желтого, зеленого, черного, серого, белого цвета.

Актиномицеты растут на обычных бактериологических средах – сывороточном мясо-пептонном агаре, кровяном агаре и на агаризированной среде с сердечно-мозговой вытяжкой. Можно использовать среды Сабуро, Чапека. Посевы инкубируют как в аэробных, так и в анаэробных условиях в течение 1-2 недель. Некоторым медленно растущим штаммам может требоваться инкубация даже до 1 месяца. Поэтому питательную среду наливают в чашки Петри толстым слоем, чтобы избежать ее полного высыхания, и помещают во влажную камеру. Ветвящийся мицелий на поверхности агара можно наблюдать в микроскопе уже через 24 часа после посева, видимые невооруженным глазом колонии появляются обычно на 3-4 сут, а зримый воздушный мицелий со спорами может появиться лишь через 7-14 суток.

Биологический метод при работе с актиномицетами практически не применяется, хотя известно, что к нокардиям при внутрибрюшинном заражении восприимчивы морские свинки и кролики.

Риккетсии

Риккетсии являются облигатными внутриклеточными паразитами и не размножаются на искусственных питательных средах. Для их культивирования используют живые системы.

1. Эпидермо-мембранный метод (метод А.В. Пшеничного и Б.И. Райхера). Принцип его заключается в том, что с кожи трупа снимают путем термической обработки эпидермальный слой в виде тонкой пленки, то есть тончайшей мембраны. Эпидермальную мембрану натягивают на кормушку и закрепляют. В кормушке на эпидермо-мембрану высыпают вшей, а под мембрану подводят небольшое количество дефибринированной крови, содержащей риккетсии. Кормушку нагревают до 32-37⁰С. Вши сосут кровь и заражаются риккетсиями. Размножаясь в эпителиальных клетках кишечника риккетсии через 8-9 дней накапливаются во вшах. Затем их растирают в ступке, и взвесь очищают путем фильтрации и центрифугирования (в настоящее время метод имеет историческое значение).

2. Метод Кокса (заражение куриных эмбрионов в полость желточного мешка). Для этого используют 6-7-дневные эмбрионы. Работа производится в боксах с тщательным соблюдением стерильности. После дезинфекции 50% спиртом и 5% йодной настойкой скорлупы тупого конца яйца пробуравливают отверстие над вершиной воздушной камеры и в него вводят шприц, содержащий 0,4-0,5 мл инфицирующего материала. Контролируя положение иглы с помощью овоскопа, прокалывают хорион-аллантоисную оболочку, проходят аллантоисную полость и входят в желточный мешок. Отверстие в скорлупе закрывают расплавленным стерильным парафином, и зараженные эмбрионы помещают в термостат при 35-37⁰С. Максимальное накопление риккетсий происходит на 8-10 день. Риккетсии размножаются в ткани стенки желточного мешка и при гибели клеток легко из них освобождаются. При вскрытии зараженных эмбрионов желточный мешок извлекают стерильным пинцетом и из него готовится суспензия на стерильном физиологическом растворе, которую используют для приготовления риккетсиозных антигенов и вакцин.

3. Метод культуры тканей. Риккетсии можно выращивать в культурах invitro на многих типов клеток млекопитающих: Hep-2, HeLa, Detroit-6 (костный мозг грудины человека), L-мышиных фибробластах, фибробластах куриных эмбрионов и других. Метод культуры ткани не нашли широкого применения для выделения и идентификации риккетсий, но позволили выяснить вопросы взаимоотношения возбудителя с клеткой- хозяином. Риккетсии культуре клеток накапливаются медленно и в небольшом количестве, поэтому клеточные культуры нужно поддерживать в течение нескольких недель, прежде чем появятся признаки инфекции. При инфицировании клеток риккетсии не остаются в цитоплазме до ее деструкции, а свободно выходят и проникают в соседние клетки. Температурный оптимум - 32-35⁰С, рН – 7,4-7,8, солевой состав в культуральной среде обеспечивается смесью жидкости Тироде с сывороткой морской свинки или кролика.

4. Метод заражения лабораторных животных (биологический метод). В настоящее время для культивирования риккетсий широко используют морских свинок и белых мышей. Других животных заражают редко, только для специальных исследований. Морских свинок заражают внутрибрюшинно или интратестикулярно (в толщу яичек). У животных развивается лихорадка, а в случае эндемических риккетсиозов развивается специфический периорхит, сопровождающийся накоплением риккетсий в мезотелии влагалищных оболочек яичка. Риккетсии выделяют из крови, селезенки, почек, надпочечников, но особенно много их в мозговой ткани животного. Для размножения риккетсий Провачека чаще всего используют белых мышей, заражая их интраназально. Наиболее чувствительны молодые мыши, весом 10-15 г. Инфицирование их производится под эфирным наркозом с инсталляцией в ноздри 10 кап риккетсиальной взвеси. При такой дозе мыши погибают на 4-5 сут. При вскрытии извлекают легкое, из которого, в среднем, получают до 20-25 млрд. риккетсий.

Хламидии

Хламидии вызывают у человека орнитоз, трахому, бленнорею новорожденных с включениями, болезнь Рейтера, венерическую лимфогранулёму, урогенитальные инфекции. Хламидии, также как и риккетсии культивируются в организме чувствительных животных, в культурах тканей, в желточном мешке куриного эмбриона.

1. Биологический метод. Исследуемым материалом заражают новорожденных морских свинок и белых мышей. Новорожденные мыши погибают при внутримозговом заражении через 5-10 сут от пневмонии. При внутрибрюшинном заражении гибель животных отмечается на 3-4 сут на фоне пневмонии и перитонита. При микроскопическом исследовании клеток пораженных органов обнаруживаются хламидийные включения, наибольшее количество возбудителя отмечается в легких, печени, селезенке.

2. Заражение куриных эмбрионов. Наиболее эффективно заражение 7-дневных куриных эмбрионов в желточный мешок и 9-11-дневных в полость аллантоиса. Гибель эмбрионов происходит уже на 4 сут, температура инкубации 36⁰С. Препараты отпечатки и мазки окрашивают акридиновым оранжевым, по Романовскому-Гимзе, Макклавелла и исследуют под микроскопом для обнаружения включений. При отрицательных результатах делают слепые пассажи, то есть из желточных мешков готовят 20% суспензию на фосфатном буфере, которой вновь заражают партию новых куриных эмбрионов.

3. Метод культуры тканей. Исследуемым материалом заражают культуры клеток – L; Hep-2; HeLa; линии клеток Мак-Коя. Эффективность заражения клеток хламидиями возрастает при обработке культуры цитостатиками или центрифугирования после внесения инфицированного материала в культуру. Культуры клеток обычно выращивают на покровных стеклах, которые вынимают, фиксируют и красят через 24-28 час после заражения. Если цитоплазматические включения хламидий не обнаруживаются, культивирование продолжают до 6-10 сут (температура 35-36⁰С). К этому сроку при наличии хламидий в монослое клеток формируются цитолитические бляшки (зоны гибели клеток).