Оцінка результатів мікроскопії

* Вказати точну кількість КСБ.

**Відповідність градації: 1+ поодинокі КСБ у п/з; 2+ помірна кількість КСБ; 3+ значна кількість КСБ.

На підставі бактеріоскопічного дослідження можна зробити висновок тільки про наявність чи відсутність у препараті кис­лотостійких мікобактерій та їх кількість.

Бактеріологічний метод.Хворий на туберкульоз у процесі антибактеріального лікування може виділяти МБТ морфологічно змінені та в малій кількості, які неможливо виявити бактеріоскопічними методами. Тому в комплексі досліджень, спрямованих на виявлення МБТ, обов'язковим є посів патологічного матеріалу на живильні середовища для виділення культури МБТ. Виділення культур МБТ дає змогу визначити життєздат­ність збудника, його медикаментозну чутливість, ферментативну активність та вірулентність.

Бактеріологічний методскладається з посіву матеріалу на поживне середовище і диференціації культури МБТ від кислотостійких сапрофітів. Цим методом можна виявити мікобактерії туберкульозу тоді, коли в 1 мл матеріалу перебуває 20 – 100 мікробних клітин.

Перед тим, як направляти діагностичний матеріал на посів, хворому потрібно не менше, ніж на 2 доби відмінити антимікобактеріальні препарати.

Методика проведення бактеріологічного дослідження: на живильне середовище наносять 2,0 - 3,0 мл стерильної дистильованої води (не фізіологічного розчину !) та за допомогою пастерівської піпетки відсмоктують отриману суспензію харкотиння, переносять у стерильну центрифужну пробірку, додають 12 - 15 крапель 10% розчину їдкого лугу, добре струшують до повної гомогенізації і центрифугують 10 хвилин. Отриманий осад використовують для посіву на середовища. Пробірки із середовищем ставлять в термостат при температурі 37°С. Перші колонії мікобактерій можуть з’явитися на 18 – 30-й день, а іноді – через 2 – 3 місяці. Бактеріологічне дослідження проводять одночасно з бактеріоскопічним тричі.

Посів досліджуваного матеріалу проводиться на спеціальні середовища після попередньої обробки. Найчастіше використовують такі середовища: Левенштейна-Йєнсена, Фінна-2, Міддлбрука, Огави та ін.), які містять речовини, що затримують ріст сторонніх мікроорганізмів. Попередня обробка патологічного матеріалу полягає у знищенні супровідної бактеріальної флори. Посів матеріалу з бронхів, а також посів сечі роблять з центрифугату або осаду. При цьому сечу, якщо вона не забруднена, можна не обробляти.

Для підготовки до посіву мокротиння, плеврального ексудату, цереброспінальної ріди­ни існує кілька методів попередньої обробки.

Метод Мазура полягає в обробці патологічного матеріалу 3 – 4 мл 2% розчином сірчаної кислоти у стерильній пробірці. Пробірку струшують протягом 3 хв., після чого матеріал стерильною платиновою петлею наносять на яєчні середовища.

Метод Петрова: мокротиння обробляється 4% розчином гідроксиду натрію про­тягом 15 хв., а потім центрифугується.

Біологічний метод – це прищеплювання патологічного матеріалу тваринам. Гвінейським свинкам або білим мишам у пахвинну ділянку або в черевну порожнину вводять досліджуваний матеріал в дозі 2 - 3мл. Для цього його спочатку обробляють 3 - 8% розчином соляної кислоти, добре відмивають (інакше на місці введення може виникнути некроз тканин, можлива навіть смерть тварини від дії кислоти).

Незабруднену сечу і цереброспінальну рідину можна прищеплювати без поперед­ньої обробки. При наявності в патологічному матеріалі вірулентних штамів МБТ тва­рини захворівають на туберкульоз і гинуть через 1 - 2 місяці після зараження. Якщо МБТ має ослаблену вірулентність, тварина гине пізніше або може зовсім не загинути. У таких випадках тварину забивають і діагноз встановлюють після розтину, макро- і мікроскопічного виявлення туберкульозних горбків. Діагноз можна також поставити на підставі прижиттєвого дослідження збільшеного реґіонарного лімфатичного вузла або інфільтрату, що виник на місці інокуляції патологічного матеріалу. Для виявлення культур МБТ біологічним методом в 1мл матеріалу достатньо 5 мікробних клітин.

В останні роки для диференціації мікобактерій використовують метод газорідин­ної хроматографії, що ґрунтується на високій роздільній спроможності різних сполук (амі­нокислот, нуклеїнових кислот, жирів, вуглеводів і т. ін.). При цьому не виключається етап культивування збудника на поживних середовищах, що можна віднести до не­доліків методу.

Прискорені методи виявлення мікобактерій. До прискорених методів виявлення мікобактерійналежать виявлення МБТ за допомогою індикаторної пробірки BBL MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube). Ріст мікобактерій туберкульозу відбувається протягом 4 - 10 діб. Пробірки BBL MGIT містять бульйон і флуоресцентну сполуку, що реагує на кисень, розчинений у бульйоні. Вихідна концентрація кисню не дає яскравого світіння. При поглинанні кисню культу­рою МБТ спостерігається яскрава флуоресценція на дні пробірки. Такий результат вважають позитивним. Якщо флуоресценції немає або вона незначна – результат нега­тивний. Показання пробірок враховують щодня, починаючи з другого дня інкубації.

Останнім часом для діагностики туберкульозу використовують імуноферментні та молекулярно-генетичні методи.

З'явились методи ідентифікації МБТ за допомогою моноклональних антитіл, отри­маних способом гібридомної технології. Зараз існує понад 100 моноклональних антитіл щодо епітопів основних антигенів МБТ. Застосування цих антитіл в імуноферментному аналізі дає можливість дуже швидко диференціювати вид збудника, але поки що метод використовується в наукових розробках для ідентифікації збудника туберкульозу, який найчастіше зустрічається (M.tuberculosis і M.bovis).

Серед молекулярно-генетичних методів діагностики туберкульозу найчастіше за­стосовується метод ДНК-зондів та полімеразно-ланцюгової реакції (ПЛР). В ос­нові цих методів лежить принцип комплементарності нуклеотидних основ у побудові двоспіральної молекули ДНК. При проведенні ДНК-зондування у випадку наявності у пробі, що досліджується, специфічної ділянки ДНК мікобактерій утворюється гібрид (дволанцюговий фрагмент) ДНК, що досліджується та ДНК-зонду.

В основі принципу ПЛР лежить багаторазове збільшення фрагмента ДНК. Для амплі­фікації (багаторазового подвоєння гена бактерій) потрібна наявність двох праймерів (затравок) – невеликого одноланцюгового фрагмента ДНК, що з'єднується з комплемен­тарною ділянкою одного з ланцюгів матричної ДНК. Надалі відбувається добу­дова цього ланцюга ДНК-полімеразою. Збільшення кількості (в 106 разів) фрагмента, що ампліфікується, виявляється електрофорезом в агаровому гелі. Врахування резуль­татів реакцій здійснюється під пластинами трансілюмінатора в ультрафіолетовому світлі. ДНК-зондування дозволяє проводити визначення мікобактерій в діагностичному матеріалі протягом 2 - 4діб, а ПЛР – за 4 - 6 годин з максимально високою чутливістю методів – 10 – 100 – 1000 клітин у пробі, що досліджується.

Окрім мокротиння, в якості патологічного матеріалу для проведення мікробіологічних досліджень, можуть використовуватись інші біологічні рідини та тканини (переважно для діагностики позалегеневих форм туберкульозу)