Защитные свойства глицерина и ДМСО.

1 Причинами гибели спермиев при замораживании неразбавленной спермы являются:

- изменение концентрации солей в плазме спермы. Вода плазмы замерзает, а соли отлагаются. Создаётся гипертоническая среда.

- переход мелких кристаллов в крупные – т.е. механическое повреждение протоплазмы спермиев.

Для предохранения спермиев от гибели при замораживании спермы применяют глицерин и ДМСО. Их защитные действия сводятся:

- они отнимают влагу и спермии легко переносят зону кристаллизации при замораживании;

- они замерзают позднее, чем вода (сперма с глицерином замерзает при -10⁰ С);

- они обладают диффузностью и легко проникают в клетку и обратно;

- они обладают вязкостью, а вязкая среда трудно кристаллизуется.

Замораживание спермы быка в полипропиленовых соломинках.

В 1975 году Л.Кассу (Франция) впервые применил соломинки из пропилена для фасовки спермы быков ёмкостью 0,5 мл.

Для разбавления спермы быка применяют Лактозо-Глицерино-Желточную среду. В зависимости от активности и концентрации сперму быка разбавляют в 20-50 и более раз, с таким расчётом, чтобы в дозе было не менее 15 млн. спермиев с прямолинейно-поступательным движением. После предварительной оценки сперму переливают в градуированный смеситель ёмкостью 100-200 см³ и измеряют объём. Разбавитель, подогретый до температуры 25…30°С, небольшими порциями приливают по стенке ёмкости со спермой и осторожно перемешивают после добавления каждой порции. Разбавленную сперму расфасовывают в стерильные полипропиленовые соломинки ёмкостью 0,25 см³. Каждую соломинку маркируют (указывают наименование предприятие, кличку и инвертарный номер быка, дату получения спермы и номер серии.

Для автоматического наполнения соломинок спермой и укупорки используют машину М6-МУ2-С. В цилиндр наливают разбавленную сперму, а специальное устройство наполняют стерильными стеклянными или металлическими шариками для укупорки. Соломинки укупоривают с обоих концов: один шарик служит в качестве пробки-поршня, другой - герметизирующей пробкой. На каждой соломинке делают надписи маркировочной машиной, указывающие наименование предприятия, кличку и инвентарный номер быка, а также дату получения спермы, номер серии. После наполнения соломинок между спермой и одним из шариков остаётся воздушный пузырёк длиной 8-18 мм. Чтобы воспрепятствовать попаданию жидкого азота внутрь соломинок во время замораживания и хранения, пузырёк перемещают в середину соломинки путём энергичного встряхивания. Соломинки устанавливают в штативы, которые выдерживают в холодильнике 3-4 часа при 2-4⁰ С. Замораживают сперму на щите из нержавеющей стали толщиной 1,5-2 мм в стационарном хранилище в газообразном азоте при температуре – 150⁰ С в течение 7 минут. Одновременно замораживают до 750 спермодоз. После замораживания соломинки со спермой помещают в пластмассовые стаканы, предварительно наполненные жидким азотом. Для сбора соломинок используют специальный собиратель с деревянной ручкой. Хранят замороженную сперму в стационарных хранилищах типа КВ-6202,ХБ в пластмассовых стаканах полностью погруженных в жидкий азот.

Замораживание спермы быка в облицованных гранулах.

Для разбавления спермы используют два устройства, которые заполняют средами 1 и 2. Устройство со средой 1 размещают в термостате при температуре 35⁰ С, устройство со средой 2 используют в условиях 18-22⁰ С. После получения сперму разбавляют средой 1 в соотношении 1:1 и выдерживают при комнатной температуре в течение 5-10 минут, до окончания оценки эякулята. Затем дополнительно её разбавляют средой 2, имеющей комнатную температуру, до требуемой концентрации спермиев в дозе, согласно таблиц. Фасуют разбавленную сперму в стерильную тонкостенную полимерную трубку диаметром 3,8-4 мм, которая выпускается в виде бабин. Заполненную спермой трубку заправляют в автомат ПРЖ, который автоматически разделяет её на спермодозы объёмом 0,25-0,33 см³. Спермодозы собирают в маркированные алюминивые тубы. Затем тубы ввинчивают в обоймы устройства для эквилибрации и замораживания спермы (ЭКЗ). Устройство помещают в холодильник (2…5⁰ С), где сперма выдерживается в течение 4-6 часов при постоянном вращении со скоростью 2-10 об/мин.мс. После эквилибрации сперму замораживают в течение 8-10 минут в жидком азоте.