Флуоресцентные спектрометры.

Итак, принцип флуорометрии заключается в том, что вещество возбуждается источником света, после чего интенсивность флуоресцентной эмиссии измеряется как функция длины волны возбуждения и эмиссионного излучения. В отличие от абсорбционной спектроскопии, при флуоресценции всегда рассматриваются две длины волн – длина волны возбуждения и длина волны эмиссионного излучения. Как и любой спектрометр, флуорометр состоит из следующих основных узлов: источника света с выбираемой длиной волны, носителя пробы и приёмника излучения. Здесь различают фотометры и сканирующие (растровые) флуорометры. Простые устройства используют оптический фильтр для выбора длины волны возбуждения и эмиссионного излучения. Такие фотометры предназначены для количественных анализов.

Для сканирующих приборов требуются монохроматоры с дифракционной решёткой (рис. 4). В отличие от классических двухлучевых исполнений в абсорбционной спектроскопии, сканирующие флуорометры выполнены в виде однолучевого устройства. Рассеиваемый во все направления пространства флуоресцентный свет детектируется под углом 90° к падающему световому лучу с максимально большим пространственным (телесным) углом. Расстояние между кюветой и детектором должно быть как можно меньше. Для регистрации флуоресцентного свечения с как можно большим телесным углом в качестве детектора применяют почти исключительно фотоумножитель с фотокатодом большой площади. Диодные же матрицы, играющие доминирующую роль в абсорбционной спектроскопии, по причине недостаточной площади детектора практически не используются. Для возбуждения флуоресценции используются те же источники излучения, что и в абсорбционной спектроскопии. Варьирующая в зависимости от длины волны интенсивность возбуждающего излучения компенсируется электронным способом. Для этого с помощью светоделителя одна часть монохроматического света возбуждения направляется к счётчику квантов, который измеряет интенсивность, а другая часть света возбуждает пробу. В качестве счётчика квантов используются кремниевые фотодиоды.

Рассеяние света.

Наряду с абсорбцией и эмиссией, при облучении вещества возможны также дополнительные явления рассеяния. Подобно флуоресценции, рассеянное излучение распространяется по всем направлениям пространства. При этом оно может исходить как от отдельных молекул (рассеяние Рэлея), так и от мельчайших частиц коллоидных растворов (рассеяние Тинделя). Интенсивность рассеянного излучения пропорциональна 4-й степени частоты возбуждения, то есть коротковолновое возбуждающее излучение рассеивается гораздо сильнее, чем длинноволновое.

Наряду с рассеянием Рэлея и Тинделя необходимо учитывать ещё и комбинационное рассеяние растворителя. Дело в том, что при обычных растворителях не происходит электронного возбуждения, но зато возможны колебательное и вращательное возбуждения. Возникающее при этом излучение находится в интервале более длинных волн, чем возбуждающее излучение, и может привести к смешению с излучением флуоресценции либо наложению их друг на друга. Часто удаётся путём изменения длины волны возбуждения избежать совпадения этих двух эмиссий.

Хотя интенсивность комбинационного рассеяния совсем невелика, она всё же может сильно мешать при малых концентрациях вещества, то есть при слабой интенсивности флуоресценции. Табл. 2 приводит для некоторых часто используемых растворителей положение спектральных полос комбинационного рассеяния как функцию длины волны возбуждения.

Таблица 2