В основе метода флуоресцентного определения мембраносвязанного кальция лежит способность антибиотика хлортетрациклина

В основе метода флуоресцентного определения мембраносвязанного кальция лежит способность антибиотика хлортетрациклина, локализованного в мембране, образовывать комплекс с ионом кальция, что приводит к увеличению квантового выхода флуоресценции зонда. Его свечение регистрируют с одного и того же участка клетки в течение всего времени эксперимента с помощью люминесцентного микроскопа. Возбуждение флуоресценции ХТЦ вызывают с помощью галогенной лампы накаливания, выделяя полосу за счет комбинации фильтров. Регистрацию свечения проводят с помощью фотометрической насадки, выделяя полосу с помощью интерференционных светофильтров при длине волны максимального пропускания светового пучка 490 и 550 нм.

При регистрации внутриклеточного рН в качестве зонда используют дигидроксиацетонфосфат (ДГАФ) в конечной концентрации 10^-5 моль. После 20 мин инкубации (время, необходимое для накопления в объекте достаточного для флуориметрии количества флуоресценции) клетки тщательно отмывают от экстраклеточного ФгАф. Для обеспечения постоянного рН экстраклеточной среды при инкубации клеток добавляют 50 ммоль HEPES (буфер), доводя рН раствора до 6,2 - 8,5. Спектры флуоресценции препаратов регистрируют с помощью инвертированного микроспектрофлуориметра: возбуждение флуоресценции препаратов осуществляют обычно с помощью галогенной лампы накаливания и комбинации стеклянных светофильтров. Значение внутриклеточного рН определяют по величине отношения интенсивностей флуоресценции окрашенного препарата при длинах волн 516 и 570 нм, сопоставляя его со значениями соответствующей калибровочной кривой, представляющей собой зависимость величины этого отношения от значений рН буферных растворов флуоресцеина.

Для регистрации внутриклеточного Са²⁺ после загрузки и перед началом опыта клетки промывают исходным раствором и выдерживают 30-40 мин для деэтерифицировапия и достижения равновесного распределения между связанной и свободной формами молекул зонда (fura-2 – специфический зонд для Ca) внутри клетки. Для определения содержания кальция в клетке применяют микроспектрофлуориметрический метод. Клетки помещают в перфузируемую ячейку на предметном столике инвертированного микроскопа, совмещенного со спектрофлуориметром, оснащенным ксеноновой лампой, разделителем лучей, двумя монохроматорами и двойным зеркальным чопперным механизмом, позволяющим чередовать возбуждение молекул fura-2 лучами двух длин воли - 340 и 380 нм (с частотой 100 Гц). Ширина полосы возбуждения не должна превышать 3,5 нм. Концентрацию Са²⁺ рассчитывают по отношению интенсивностей флуоресценции (505 нм) в ответ на возбуждение, вызванное лучами с длинами волн 340 и 380 нм.