Высокоспецифичная многократная флуоресценция: различные флуорофоры маркируют точно определенные структуры в цитоскелете отдельных клеток

В последние годы получает широкое распространение метод конфокальнойфлуоресцентной микроскопии, который открывает интересные перспективы для исследований.

Этот метод спектроскопирования может проводиться лишь на специальных микроскопах, а именно, посредством конфокальных микроскопов. Следует кратко осветить этот метод, так как он существенно расширяет возможности микроскопии.

В конфокальной микроскопии ( см.рис. ) параллельный световой пучок (1) отображается объективом (2) на пробу (3). В ходе лучей находятся сканеры (4), с помощью которых луч сканирует пробу (3). Генерируемый на пробе флуоресцентный свет снова возвращается через сканеры, что приводит к нейтрализации и компенсации движения луча, затем отклоняется светоделителем (5) и фокусируется на точечной диафрагме (6). За точечной диафрагмой флуоресцентный свет посредством запирающего фильтра (7) отделяется от света возбуждения и постоянно измеряется световым детектором (8). Из таких замеренных значений компьютер "складывает" электронное изображение. Решающим фактором является то, что через точечную диафрагму (6) в "пространственном фильтре" (А) проходит только флуоресцентный свет из фокальной плоскости объектива (3). Свет от других плоскостей в пробе (например, За) очень эффективно подавляется точечной диафрагмой (6). Это позволяет рассматривать отдельные плоскости пробы. С помощью компьютера создаются трехмерные изображения (3D-images).

2 3

Рис.1.4.-Ход лучей в конфокальном микроскопе.

Регулярное флуоресцентное изображение (слева,2) пересвечено и не позволяет распознать отдельные детали внутри объекта. Совсем иначе обстоит дело с конфокальным изображением (справа, 3 ), на котором четко видна отдельная плоскость внутри препарата.

Фазовоконтрастный микроскоп. В основу конструкции фазовоконтрастного микроскопа положена идея, являющаяся простой и очень плодотворной. Глаз человека и фотопластинка не регистрируют изменений фазы световой волны, но хорошо различают изменение ее амплитуды. В фазовоконтрастном микроскопе имеется специальное устройство, которое преобразует сдвиг волн по фазе (такой сдвиг происходит при прохождении света через препарат) в сдвиг по амплитуде хорошо ощущаемый глазом. Благодаря этому преобразованию изображение приобретает контрастность.

Фазовоконтрастное устройство к биологическому микроскопу (рис.5) состоит из набора фазовых объективовО, отличающихся от обычных наличием кольцеобразной фазовой пластинкиП,конденсора К с набором кольцевых диафрагм Д и вспомогательного микроскопа, который увеличивает изображение кольцевой диафрагмы и фазовой пластинки при их совмещении.

Рис. 1.5. Фазовоконтрастное устройство.

Микроскопы совершенствовались в разных направлениях. Немалую роль сыграл в этой области русский ученый-химик академик И.В.Гребенщиков.Он открыл новые пористые стекла, обладающие адсорбционными свойствами. Предложил метод обработки оптических деталей- нанесение на стекло тонких прозрачных пленок, снижающих отражение света. Так родилась знаменитая голубая (просветленная) оптика.

Рентгеноструктурный анализ изучает пространственное строение микроскопических структур с помощью лучей Рентгена. На основании данных этого метода была создана в 1953 году Уотсоном и Криком модель молекулы ДНК. Значение этой пространственной модели в том, что она хорошо объясняет физико-химические и биологические свойства ДНК и, особенно механизм воспроизведения.

Проведенные в последнее время исследования ставят на повестку дня вопрос, служит ли ДНК единственной структурой, несущей генетическую информацию, или хранение и передача информации осуществляется в клетках также и на других уровнях.

Очевидно в настоящее время единственной системой потока информации суть которой мы начинаем постигать - это система исходным пунктом которой является ДНК. Открытие этой системы потока информации - триумф современной биологии.

В настоящее время выясняется, что ДНК не есть абсолютное начало биохимического потока информации, т.к. на нее могут оказывать влияние сигналы, поступающие к ней из других участков клетки.

Радиоавтография дает возможность наиболее полно изучить обмен веществ в различных структурах. В основе метода лежит использование радиоактивных элементов или меченных ими соединений. Радиоактивные вещества в гистологических срезах выявляются с помощью фотоэмульсии, которую наносят на препараты и затем проявляют. Этот метод позволяет определить скорость обменных процессов в клетках и тканях, их характеристики. Например, скорость включения меченных аминокислот в белки, образование нуклеиновых кислот, обмен иода в клетках щитовидной железы.

Культура тканей вне организма. Выделенные из организма человека или животных клетки, маленькие образцы тканей различных органов, помещаются в специальные сосуды, которые содержат питательную среду - плазму крови, эмбриональный экстракт и стимуляторы роста клеток. Поддерживается постоянная температура близкая к температуре тела. В этих условиях клетки в течение длительного времени сохраняют основные показатели жизнедеятельности - способность к росту, размножению, дифференцировке, движению. Особую значимость метод культуры тканей имеет при проведении экспериментальных исследований на клетках и тканях человека.

Витальное (прижизненное) и суправитальное окрашивание. .При витальном окрашивании краситель вводится в организм животных. Он избирательно окрашивает определенные клетки или ткани. Например трипановый синий избирательно окрашивает макрофаги. Суправитальным окрашивание .называется окрашивание живых клеток, выделенных из организма.

Электронный микроскоп.Современная физика рассматривает световые волны не только как электромагнитные волны определенной длины и частоты.Это поток частиц, именуемых квантами или фотонами. С другой стороны электроны не только частицы с определенной массой. Летящий электрон можно рассматривать как волну, длина которой выводится из уравнения де Бройля. Чем быстрее движится электрон, тем меньше длина его волны. Разогнать электрон в пустоте можно ускоряющим напряжением. Если оно составляет 50 киливатт, длина волны электрона около 0,05А - в сто раз меньше длины волны зеленого света! Электроны можно отклонять магнитными линзами, попросту электромагнитами.

На основе изложенных положений был создан электронный микроскоп, который по внешнему виду существенно отличается от микроскопа Левенгука, но принцип работы обоих приборов одинаков.

Рассмотрим некоторые моменты конструкции электронного микроскопа в сравнении с оптическим.

Оптический микроскоп начинается с осветителя - источника энергии. Левенгук использовал для этой цели солнце или коптящую маслянную лампу. За триста лет осветитель проделал изрядный путь, превратившись в лучших конструкциях микроскопа в монохроматор, дающий свет строго определенной длины волны, что устраняет хроматическую абберацию.

В электронном микроскопе в качестве осветителя выступает электронная пушка, в которой источником электронов служит раскаленная до 2000 градусов вольфрамовая нить. Оптические системы электронного микроскопа представлены электромагнитами или постоянными магнитами, которые выполняют роль конденсатора, объектива, окуляра. Получаемое изображение проектируется на экран аналогичный экрану телевизора.

Рис. 1.6. Световой микроскоп

Рис. 1.7.Электронный микроскоп

А Б В

Рис. 1.8.Оптические схемы ( А ) светового микроскопа , ( Б ) трансмиссионного и ( В ) сканирующего электронных микроскопов ( по M. Ross ).

Сканирующий (растровый) электронный микроскоппозволяет изучить трехмерную картину поверхности клетки. При сканирующей электронной микроскопии тонкий пучок электронов (зонд) пробегает по поверхности объекта и полученная информация передается на электронно-лучевую трубку. Изображение может быть получено в отраженных или вторичных электронах. При этом методе фиксированный и специальным образом высушенный объект покрывается тонким слоем испаренного металла (чаще всего золота), отражаясь от которого электроны попадают в приемное устройство, передающее сигнал на электронно-лучевую трубку. Благодаря огромной глубине фокуса сканирующего микроскопа, которая значительно больше, чем у просвечивающего, получается почти трехмерное изображение исследуемой поверхности (См.рис. В). Разрешающая способность этого типа приборов несколько ниже, чем у просвечивающих электронных микроскопов, но уже сейчас выпускаются приборы с разрешением 3—5 нм.

С помощью растровой электронной микроскопии можно получить информацию о химическом составе в тех или иных участках клеток. Так, метод рентгеноспектрального микроанализа основан на .идентификации и количественной оценке содержания химических элементов по спектрам характеристического рентгеновского излучения, возникающего при взаимодействии первичных электронов с атомами. Для получения такой информации, конечно, объекты не следует покрывать слоем металла, как при обычном методе сканирующей электронной микроскопии. Более того, объект нужно подготовить так, чтобы не было потери или дополнительного внесения элементов. Для этого используют быстро замороженные и высушенные в вакууме объекты.

Рекордное разрешение современного электронного микроскопа меньше 1,5А.Теоретически разрешающая способность электронного микроскопа около 0,025А.Практически дальше 1,5А идти трудно - мешают абберации. Электронныей микроскопы первого класса увеличивают в 250 тысяч раз.Этот прорыв в тайны микромира не уступает по своему значению тому, который 300 лет назад совершил А.Левенгук. Сравните 1,5А и 700 тыс.А (0,07мм) таковы размеры пути, пройденного человечеством в этой области знаний от Левенгука до наших дней за 300 лет.