Методы микроскопических исследований

Развитие гистологии теснейшим образом связано с микроскопом, который является основным инструментом исследователя. Каждое новое усовершенствование конструкции микроскопа приводит к расширению и углублению наших знаний в области цитологии, гистологии, гистохимии.

В настоящее время большинство исследователей считают, что первый микроскоп был создан А. Левенгуком. Прежде, чем говорить о работах Левенгука и вообще о принципах конструкции микроскопа нужно остановиться на особенностях нашего зрения. Человек, не нуждающийся в очках, на расстоянии 25 см от рассматриваемого объекта может различить предмет размером 0,07-0,08 мм. Расстояние между светочувствительными клетками сетчатки не позволяет видеть предмет под углом меньше 1 условной минуты.

Разрешающая способность микроскопа(минимальное расстояние между двумя точками, которое различает глаз) согласно теории Аббе равна одной трети длины световой волны.

Абберрация - отклонение. Сферическая абберация - лучи проходят через линзу и преломляются в центре и по краям неодинаково.

Хроматическая абберация - изображение окружено радужным ореолом т.к. световое излучение, содержащее различные длины волн преломляется линзой неодинаково.

Первым человеком, преодолевшим эти препятствия и вплотную подошедшим к теоретическому расчету одиночной линзы, был голландский торговец сукном и пристав судебной палаты города Дельтфа Антоний Левенгук. Он сам шлифовал линзы из хрусталя и стекла и добился успеха невероятного даже в наши дни - увеличения в 150-300 раз. После смерти А. Левенгука секрет изготовления линз был утерен и по-видимому навсегда.

В историю Антоний Левенгук вошел как изобретатель микроскопа, но он довел до совершенства старый метод шлифовки одиночной двояковыпуклой линзы. Он первым увидел инфузории, мужские половые клетки, поперечную исчерченность скелетных мышц, движение эритроцитов по капиллярам.Слава о Левингуке гремела по всей Европе. Петр 1 посетил Левенгука во время путешествия по Западной Европе. Левенгук показал Петру 1 движение эритроцитов в капиллярах молодого угря.

Настоящего совершенства оптический микроскоп достиг значительно позже - во второй половине ХIХ века, когда физик и математик Эрнст Аббе разработал современную теорию микроскопа, на основе которой механик Карл Цейсс построил первые объективы апохроматы. Хроматическая и сферическая абберация в них появляются только при очень больших увеличениях.

Карл Цейсс (1816 - 1888 )

Эрнст Аббе (1840 – 1905 )

Примерно в тоже время препараты научились окрашивать, и это позволило увидеть тончайшие детали тканей и составляющих их клеток. Не будь окрашивания, мы бы не увидели хромосом (хромосома в переводе означает "окрашивающееся тело").

Развитие наших знаний о микроскопическом строении органов и тканей углублялось по мере усовершенствования микроскопа.

Теоретически по расчетам Эрнеста Аббе разрешающая способность микроскопа равняется 1/3 длины световой волны. На практике она соответствует 1/2 длины световой волны.Поэтому обычный оптический микроскоп отказывается работать при разрешающей способности менее 2000 А. Ангстрем (А) - единица длины равная 0,1ммк, или 0,0001мк,или 10^-8 степени сантиметра. В ангстремах измеряются субмикроскопические структуры клеток, открываемые с помощью электронного микроскопа. Название этой единицы длины дано по имени шведского физика Ангстрема (1814- 1874 гг.) А.

Наш глаз наиболее чувствителен к свету с длиной волны порядка 5000 Следовательно придел разрешения обычного микроскопа 2000-2500 ангстрем. Вывод из данной ситуации напрашивается сам. Можно взять вместо видимого света ультрафиолетовый (длина волны около 2000 А).ультрафиолет поглащается обычным стеклом, но поглащения можно избежать, если сделать линзы из кварца или построить микроскоп на вогнутых зеркалах. Изображение в ультрафиолете проектируется на светящийся экран или фотопластинку.

УФ лучи, примененные для микроскопических исследований, послужили в принципе основой для широкого развития спектроскопических исследований в цитологии и гистологии, на основе которых развилось очень перспективное направление - цитоспектрофотометрия.

Поводом для этого послужило свойство УФ лучей-сильное поглощение важнейшими компонентами клетки - белками и нуклеиновыми кислотами. Поэтому резко возрастает контрастность изображения и отпадает необходимость в окраске препарата, фазовом контрасте и т.д.

Ультрафиолетовый микроскоп был создан примерно 90 лет назад, но и сейчас применяется во многих областях естествознания. Он дает разрешающую способность до 1200 А.

В последние годы широко используемая ранее единица измерений Ангстрем (А) применяется редко.

Линейные единицы измерения, используемые при гистологических исследованиях:

1 миллиметр (1 мм) = 10^-3 м = 10³ мкм = 10 ⁶ нм = 10 ⁷ А

1 микрометр (1 мкм) = 10 ^{– 6}м = 10^-3мм = 10 ³ нм = 10 ⁴ А

1 нанометр (1нм) = 10 ^{– 9} м = 10 ^–6мм = 10 ^{– 3} мкм = 10 А

1 ангстрем ( 1 А) = 10 ^–10 м = 10 ^–7 мм = 10 ^{– 4} мкм = 10^-1 нм

Одним из важнейших достижений гистологической техники второй половины 19 века явилось, связанное с именем выдающегося чешского ученого Яна Пуркинье , создание микротома - прибора, позволяющего резать различные ткани и органы животных и растений на тонкие прозрачные пластинки толщиной несколько микрометров, которые можно рассматривать в микроскопе при увеличении до 2000 раз и более.

Начиная с 70 годов 19 века, применение микротома и введение в гистологическую технику красителей, оказало большое влияние на расширение и углубление наших знаний о микроскопическом строении органов и тканей.

Систематизация полученных знаний привела к созданию классификации тканей животных и человека (Р. Келликер и Ф. Лейдиг).Были выделены четыре основные группы тканей. Это открытие заложило основы учения о тканях.

Ян Пуркинье (1787 – 1869)–чешский естествоиспытатель и общественный деятель;один из основоположников учения о клеточном строении животных и растений,основатель пражской гистологической школы.Я.Пуркинье – автор многочисленных работ в области физиологии,анатомии,эмбриологии,гистологии;его исследования сыграли важную роль в формировании современной экспериментальной физиологии.

1.1. Изготовление гистологических препаратов для световой ( А ) и электронной ( Б ) микроскопии.