Диагностические методы и объекты исследования

Физиологические жидкости. Большинство сведений о врожденных «ошибках» метаболизма и методах их выявления было получено в результате химических исследований крови или мочи, позволивших обнаружить специфические биохимиче­ские нарушения и во многих случаях открыть пути к изучению ферментов и вы­яснению конкретного дефекта. Они дали также возможность скрининга крупных популяций, облегчив тем самым выявление больных еще до появления у них явных клинических симптомов. Использование методов скрининга по крови и моче позволило обнаружить гетерозиготных носителей многих заболеваний. Эти методы часто помогают также проследить эффекты некоторых диетических и лекарствен­ных средств или заместительной терапии.

Анализ тканей. Определение ферментов и биохимические исследования тканей человека, полученных путем биопсии, позволили обнаружить специфические фер­ментные нарушения более чем при 100 метаболических аномалиях. При таких заболеваниях, как наследственный сфероцитоз, цистинурия и синдром нарушения всасывания глюкозы — галактозы, in vitro были выявлены и нарушения мембран­ного транспорта. Эти исследования в дополнение к доказательствам аномальности продуктов отдельных генов часто позволяют идентифицировать биохимическую и генетическую гетерогенность, свойственную врожденным «ошибкам» метаболизма.

Исследования тканей не годятся для популяционных обзоров и оказываются наибо­лее полезными, если сочетаются с выявлением изменений в крови и моче.

Клеточные культуры. Существенный вклад в биохимию и генетику врожден­ных метаболических аномалий внесли также исследования на растущих в тканевой культуре фибробластах человека. В некоторых случаях (акаталазия, галактоземия, недостаточность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, болезнь накопления гликогена II типа, экскреция с мочой повышенного количества кетокислот с разветвленной цепью или оротовой кислоты) ферментные нарушения, ранее выявленные в других тканях, были подтверждены на культуре фибробластов. При цитруллинемии и болезни Рефсума специфические ферментные аномалии вначале были обнаружены именно в фибробластах, а при синдроме Леша—Найхана нарушение активности гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазы было выявлено одновременно в эритроцитах, лейкоцитах и культивируемых фибробластах. Имеют значение и ано­малии, определяемые в клетках гетерозиготных носителей. Например, исследование облигатных гетерозигот по ряду сцепленных с Х-хромосомой признаков позволило получить подтверждение справедливости гипотезы Лиона.

Анализ ДНК. Использование методики блот-гибридизации ДНК—ДНК для диагностики наследственных метаболических нарушений явилось наиболее важным вариантом применения технологии рекомбинантной ДНК в медицине (см. гл. 58). Этот подход основывается на выделении ДНК из легко доступных тканей, на­пример лейкоцитов периферической крови, культивируемых фибробластов или клеток амниотической жидкости. После расщепления ДНК рестрикционными эндонуклеазами и определения размеров полученных фрагментов с помощью гель-электрофореза проводят реакцию с мечеными зондами к специфическим генам из конкретных локусов, ответственным за конкретные нарушения. Если моле­кулярный дефект, лежащий в основе нарушения, точно известен, как, например, при серповидно-клеточной анемии или Z-варианте a₁-антитрипсина, то можно подобрать строго определенные олигонуклеотидные зонды. В других случаях диагностика осуществляется легче путем регистрации полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, подразделяемых на семейства и служащих полезными маркерами болезни (см. гл. 58). Этот подход использован для диагностики болезни Гентингтона, фенилкетонурии, цитруллинемии, синдрома Леша—Найхана и недостаточности орнитинтранскарбамилазы.

Выявление гетерозигот. Выявление гетерозиготных носителей двояко влияет на изучение врожденных дефектов. Во-первых, оно наглядно доказывает рецессив­ность наследования заболевания независимо от того, является ли мутация ауто­сомной или сцепленной с Х-хромосомой. Во-вторых, идентификация гетерозигот­ных носителей в одной семье позволяет получить важные сведения для генетиче­ского консультирования ее членов. При заболеваниях, при которых у носителей могут появиться клинические признаки (т. е. при доминантно наследуемых де­фектах, таких как острая перемежающаяся порфирия или семейная гиперхолесте­ринемия), выявление гетерозигот имеет непосредственное клиническое значение.

Гетерозигот можно идентифицировать с помощью многих методов, исполь­зуемых для выявления дефектов у больных. В некоторых случаях для выявления носителя достаточно применить методы скрининга проб крови или мочи. В других полезными оказываются ферментативные методы. При ряде заболеваний анализ крови или мочи не позволяет разграничить здоровых лиц и гетерозиготных носи­телей, но последних помогают выявить пероральные или парентеральные нагрузки предшественником в цепи нарушенной химической реакции. Так, гетерозиготы по галактоземии и фенилкетонурии реагируют на пероральную нагрузку соответст­венно галактозой и фенилаланином более высоким уровнем их в плазме по сравне­нию со здоровыми. Носители ряда заболеваний выявляются с помощью фер­ментативных методов или по фенотипу клеток в биоптатах. Наконец, для их вы­явления и, что важно, для исключения носительства часто применяют методы гибридизации ДНК—ДНК. Обычно этими методами пользуются лишь в одном или в немногих центрах. В силу их сложности они не применяются для выявления носителей в крупных популяциях.

Пренатальные исследования. В настоящее время большой интерес вызывает выявление генетических болезней во внутриутробном периоде (см. гл. 58). Хими­ческое исследование амниотической жидкости или ферментативный анализ ее кле­ток позволил идентифицировать более 50 врожденных метаболических нарушений.

Наиболее многочисленную группу заболеваний, выявленных этим методом, состав­ляют болезни накопления мукополисахаридов и липидов, обусловленные недоста­точностью отдельных лизосомных гидролаз. Однако этим способом идентифициро­ваны и нарушения метаболизма амино- и органических кислот, углеводов и пуринов. Несколько врожденных аномалий установлено путем исследования крови плода, полученной при пункции плаценты или фетоскопическом контроле. Таким путем выявлены серповидно-клеточная анемия, b-талассемия и гемофилия. Если все эти подходы основаны на исследовании генных продуктов или метаболитов, то диагно­стика других нарушений осуществляется с помощью методики блот-гибридизации ДНК—ДНК. Последние методики особенно перспективны, так как позволяют ис­пользовать клетки, например, амниотической жидкости в культуре, которые содер­жат, но не экспрессируют гены, осуществляющие многие высокодифференциро­ванные функции, включая синтез глобина и полипептидных гормонов. Блот-гибридизация ДНК—ДНК применялась для пренатального выявления фенилкетонурии, недостаточности а i-антитрипсина, гемофилии, серповидно-клеточной анемии, талас­семии и недостаточности орнитинтранскарбамилазы.