Основы молекулярной биотехнологии - III

Амплификация

Амплификация (от англ. аmplification – увеличение) – это образование дополнительных копий хромосомных последовательностей. Благодаря этому можно повысить эффективность биообъектов, используемых в производстве. Множественные копии определенных фрагментов ДНК получают in vitro с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР является высоко чувствительной и специфичной, она позволяет обнаружить и исследовать даже единичную копию гена.

Для ПЦР необходимо: два синтетических олигонуклеотидных праймера (короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, который служит стартовой точкой при репликации ДНК) длиной ~20 нуклеотидов; ДНК-мишень; термостабильная ДНК-полимераза, которая не теряет активность при температуре 95ºС и выше; четыре дезоксирибонуклеотида.

ПЦР-амплификация – это многократное повторение трех реакций:

1.Денатурация – образец ДНК выдерживают при температуре 95ºС в течение 1 минуты. В среде должны находиться 2 праймера, ДНК–полимераза, 4 дезоксирибонуклеотида.

2.Ренатурация. Температуру смеси медленно понижают до 55ºС, при этом праймеры спариваются с комплементарными последовательностями ДНК.

3.Синтез. Температуру смеси повышают до 75ºС, при этом начинается полуконсервативный синтез комплементарной цепи ДНК. Каждый из этих циклов длиться 3-5 минут.

Полученные новые нити ДНК являются шаблонами (матрицами) для других праймеров. Это вызывает экспоненциальное увеличение нужных участков ДНК. Процесс носит цепной характер. ПЦР применяют для идентификации патогенных микроорганизмов, возбудителей заболеваний человека, животных и растений, спонтанных мутаций, а также сборки генов.

Экспрессия генов

Экспрессия генов – проявление функциональная активность генов во время транскрипции и трансляции. Так были получены и внедрены в производство штаммы бактерий и дрожжей, которые способны продуцировать инсулин, соматотропин, интерферон, интерлейкины и другие биологически активные вещества. Созданы растения с повышенной кормовой и питательной ценностью, более значительным фотосинтезом и азотфиксацией, устойчивые к различным фитопатогенам. Большую перспективу открывает технология трансгенных животных. Создано стадо овец с геном человека, который контролирует выработку факторов свертываемости крови, используемых для лечения людей. Сконструированы бактерии, которые очищают каменный уголь от серы и превращают его в жидкое и газообразное топливо.

Технологическая схема клонирования и экспрессии генов следующая:

1.сортинг хромосом и получение ДНК;

2.введение ДНК в вектор;

3.трансформация, трансфекция, трансдукция и др.;

4.обнаружение и накопление клона клеток;

5.выделение рДНК (плазмиды);

6.определение нуклеотидной последовательности в клонированном фрагменте ДНК;

7.конструирование и построение плазмиды для экспрессии ее функций;

8.обнаружение и накопление клона;

9.выделение плазмиды и проверка нуклеотидной последовательности в рДНК;

10.трансформация;

11.выращивание культуры для получения экспрессируемого белка;

12.выделение белка.