Общая схема конструирования рДНК
Конструирование осуществляется in vitro. Кольцевая молекула вектора разрезается рестриктазой. Полученная линейная молекула ДНК должна содержать липкие концы, комплементарные концам вводимой ДНК. Эти концы вектора и концы вводимого гена сшивают ДНК-лигазой. Этот же фермент замыкает линейную молекулу ДНК в единую кольцевую структуру.
Введение рДНК в клетку осуществляют следующими способами: 1) Трансдукция – если рекомбинантные векторы упакованы в инфекционной фаговой частице, то их можно вводить в бактериальную клетку путем естественного проникновения фага в клетку; 2) Трансформация – введение в клетку фрагментов нативной ДНК; 3) Трансфекция – введение голой фаговой ДНК.
Клетки должны быть компетентными к вводимой рДНК. Это достигается обработкой клетки хлористым кальцием, тепловым ударом или лизоцимом. Эффективность трансформации увеличивают диэтиламиноэтилдекстран и полиэтиленгликоль. Дрожжи становятся компетентными под влиянием литиевых солей и электроимпульсов. В клетки высших организмов ДНК вводят микроинъекцией.
Обычно частота трансформации невысока – одна клетка на несколько тысяч или десятков тысяч клеток. Кроме того, не все клетки содержат клонируемый ген.
Так, сконструированы векторы для прямого отбора рекомбинантных трансформированных клеток. Эти векторы содержат летальный ген для реципиентной, но не трансформированной клетки. В такой ситуации колонии способны образовывать только те клетки, в которых находятся клонируемые гены. Нуклеотидные последовательности таких клеток можно идентифицировать с помощью специфических полинуклеотидных зондов, меченых радиоактивными изотопами.
Трансформированные с экспрессирующим вектором клоны можно отбирать также по продукту введенного гена. Так, внесение генов амилаз в клетки, не растущие на крахмале, обеспечивают рост на этом субстрате только тех клеток, которые были подвергнуты трансформации.
Важным этапом клонирования генов является сохранение рекомбинантных ДНК.
В клетках, например, в E. coli, всегда присутствуют эндонуклеазы, которые расщепляют введенные молекулы рДНК. Для предотвращения этого используют мутантные клетки Е. coli, на которые эндонуклеазы не действуют.
Часто продукты, которые синтезированы по информации введенных генов, разрушаются протеазами. Поэтому используют мутанты со сниженной активностью протеаз.
Меньше разрушаются длинные полипептидные молекулы. Так, к вектору β-галактозидазы присоединяют ген какого-либо полипептида, который удаляют после синтеза нужного продукта.
Вопросы для самоконтроля
1) Генетическая инженерия.
2) Генная инженерия.
3) Геномная инженерия.
4) Хромосомная инженерия.
5) Какие задачи можно решить с помощью генетической инженерии?
6) Что такое рекомбинантная ДНК (рДНК)?
7) Источники ДНК.
8) Способы получения гена.
9) Ферменты для получения рекомбинантных ДНК.
10) Секвенирование. Принципы секвенирования.
11) Векторы. Типы векторов.
12) Общая схема конструирования рДНК.
13) Способы введения рДНК в клетку.
14) Сохранение рекомбинантных ДНК.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Основная
1. Биотехнология: учебное пособие для вузов, в 8 кн., под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. – М., 1987.
2. Блинов, В.А. Общая биотехнология: курс лекций. В 2-х частях. Ч. 1 / В.А. Блинов. – Саратов, 2003.
3. нак. – М.: Мир, 2002. – 592 с. – ISBN: 5-03-003328-9
Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастер
4. Елинов, Н.П. Основы биотехнологии / Н.П. Елинов. – СПб.: Наука, 1995. – ISBN 5-02-026027-4
5. Сельскохозяйственная биотехнология / Шевелуха В.С. и др. – М.: Высшая школа, 2003. – 427 с. – ISBN: 5-06-004264-2
Дополнительная
1. Генетически модифицированные растения и продукты питания: реальность и безопасность. Аналитический обзор. – М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2005. – 200 с. – ISBN: 5-7367-0543-5
2. Клунова, С.М. Биотехнология: учебник / С.М. Клунова, Т.А. Егорова, Е.А. Живухина. – М.: Академия, 2010. – 256 с. – ISBN 978-5-7695-6697-4
3. Общая биотехнология в таблицах, рисунках и схемах: учебно-методическое пособие / сост.: Блинов В.А. – Саратов: 410005, Саратов, Пугачевская, 161, офис 320, 2008. – 102 с.
4. Пшеничникова, А.Б. Основы биотехнологии: учебное пособие / А.Б. Пшеничникова. – М.: МИТХТ им. М.В. Ломоносова, 2010. – 92 c.
5. Современные проблемы и методы биотехнологии [Электронный ресурс]: электронное учебное пособие / Н.А. Войнов, Т.Г. Волова, Н. В. Зобова и др.; под науч. ред. Т.Г. Воловой. – Электрон. дан. (12 Мб). – Красноярск: ИПК СФУ, 2009.
6. Тарантул, В.З. Толковый биотехнологический словарь русско-английский: справочное издание [Электронный ресурс] / В.З. Тарантул. – М.: Языки славянских культур, 2009. – 936 с. – ISBN: 978-5-95-51-0342-6 – Доступ с сайта научной библиотеки СГАУ – ЭБС IPRbooks
7. Тенденции развития промышленного применения биотехнологий в Российской Федерации / Институт биохимии им. Н.А. Баха РАН. – М., 2011. – 323 с.
8. http://www.biotechnolog.ru
9. Биотехнологический портат Bio-X (ссылка доступа - http://bio-x.ru)
10. Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология» (ссылка доступа – http://cbio.ru)
11. Оn-line-журнал «Биотехнология. Теория и практика» (ссылка доступа – http://www.biotechlink.org)
Лекция 18
Дата добавления: 2016-02-27; просмотров: 1425;