Геномная библиотека

Геномная библиотека (банк генов) – это клонированный в составе векторов полный набор последовательностей ДНК данного организма. Такая фрагментация генома облегчает все генно-инженерные манипуляции, позволяет анализировать отдельные последовательности, выделять и работать с индивидуальными генами. Фрагменты геномной ДНК получают при помощи рестриктаз. Фрагменты ДНК связывают с плечами фага и упаковывают в головки фаговых частиц. Получается геномная библиотека, которая может храниться десятки лет под хлороформом, при температур – 70 ºС Поиск нужного гена проводят, заражая фаговой библиотекой бактериальные клетки и, высевая их на чашки Петра с агаризованной средой.

Кроме геномных библиотек создают библиотеки кДНК, которые представляют не все последовательности генома и не все гены, а только ту их часть, которая экспрессируется в данном организме. Можно получить библиотеки кДНК отдельных органов и тканей, характерных для различных стадий онтогенеза.

При скрининге кДНК, геномных библиотек и для анализа геномной ДНК используют метод блот-гибридизации. С помощью этого метода определяют чужеродный ген в геноме трансгенных растений, копийность гена, изменения в нуклеотидной последовательности гена и т.д.

Метод блот-гибридизации включает следующие этапы: рестрикция ДНК; перенос рестрикцированных фрагментов из геля на нейлоновый фильтр и их иммобилизация; гибридизация с меченым зондом.

Для выполнения этого метода фрагменты разрезанной рестриктазами ДНК разделяет электрофоретически в агарозном геле. Затем гель денатурируют 0,4 М раствором NaOH и покрывают его листом нейлонового фильтра. Фильтр покрывают слоями фильтровальной бумаги. Под действием капиллярных сил ДНК-фрагменты перпендикулярно переносятся на фильтр и связываются с ним, т.е. иммобилизуются. Такой перенос называется блоттинг (от англ. blot – промокать). При этом на фильтре получается реплика с геля. Фильтр помещают в раствор с радиоактивно меченым одноцепочным зондом и гибридизуют с находящимися на фильтре фрагментами ДНК. Зонд гибридизуется только с теми фрагментами, которые содержат комплементарную ему последовательность ДНК. Затем фрагменты, с которыми связался меченый зонд, выявляют радиоавтографией. По радиоавтографу судят о присутствии нужного фрагмента в геноме, изменениях нуклеотидной последовательности, о числе копий гена в геноме.

Вопросы для самоконтроля

1) Амплификация.

2) ПЦР-амплификация.

3) Экспрессия генов.

4) Технологическая схема клонирования и экспрессии генов.

5) Геномная библиотека.

6) Библиотеки кДНК.

7) Метод блот-гибридизации.

8) Блоттинг.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Основная

1. Биотехнология: учебное пособие для вузов, в 8 кн., под ред. Егорова Н.С., Самуилова В.Д. – М., 1987.

2. Блинов, В.А. Общая биотехнология: курс лекций. В 2-х частях. Ч. 1 / В.А. Блинов. – Саратов, 2003.

3. Глик, Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак. – М.: Мир, 2002. – 592 с. – ISBN: 5-03-003328-9

4. Елинов, Н.П. Основы биотехнологии / Н.П. Елинов. – СПб.: Наука, 1995. – ISBN 5-02-026027-4

5. Сельскохозяйственная биотехнология / Шевелуха В.С. и др. – М.: Высшая школа, 2003. – 427 с. – ISBN: 5-06-004264-2

Дополнительная

1. Генетически модифицированные растения и продукты питания: реальность и безопасность. Аналитический обзор. – М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2005. – 200 с. – ISBN: 5-7367-0543-5

2. Клунова, С.М. Биотехнология: учебник / С.М. Клунова, Т.А. Егорова, Е.А. Живухина. – М.: Академия, 2010. – 256 с. – ISBN 978-5-7695-6697-4

3. Общая биотехнология в таблицах, рисунках и схемах: учебно-методическое пособие / сост.: Блинов В.А. – Саратов: 410005, Саратов, Пугачевская, 161, офис 320, 2008. – 102 с.

4. Пшеничникова, А.Б. Основы биотехнологии: учебное пособие / А.Б. Пшеничникова. – М.: МИТХТ им. М.В. Ломоносова, 2010. – 92 c.

5. Современные проблемы и методы биотехнологии [Электронный ресурс]: электронное учебное пособие / Н.А. Войнов, Т.Г. Волова, Н. В. Зобова и др.; под науч. ред. Т.Г. Воловой. – Электрон. дан. (12 Мб). – Красноярск: ИПК СФУ, 2009.

6. Тарантул, В.З. Толковый биотехнологический словарь русско-английский: справочное издание [Электронный ресурс] / В.З. Тарантул. – М.: Языки славянских культур, 2009. – 936 с. – ISBN: 978-5-95-51-0342-6 – Доступ с сайта научной библиотеки СГАУ – ЭБС IPRbooks

7. Тенденции развития промышленного применения биотехнологий в Российской Федерации / Институт биохимии им. Н.А. Баха РАН. – М., 2011. – 323 с.

8. http://www.biotechnolog.ru

9. Биотехнологический портат Bio-X (ссылка доступа - http://bio-x.ru)

10. Интернет-журнал «Коммерческая биотехнология» (ссылка доступа – http://cbio.ru)

11. Оn-line-журнал «Биотехнология. Теория и практика» (ссылка доступа – http://www.biotechlink.org)

Лекция 19