Методы получения трансгенных животных

Трансгенными называют животных с измененной наследственностью, которая вызвана включением в их геном чужеродных генов с помощью следующих генно-инженерных методов:

Микроинъекции гена.Предварительно у животных гормональной обработкой вызывают суперовуляцию и проводят оплодотворение. Затем извлекают эмбрионы на стадии пронуклеуса хирургическим путем или после убоя доноров.

Для микроинъекции эмбрионов необходим стабильный рабочий стол, на который устанавливают микроскоп, два микроманипулятора для управления удерживающей и инъекционной пипетками и прибор для регулирования инъекционного давления. На столике микроскопа устанавливают инъекционную камеру со средой, покрытой парафиновым маслом. В среду помещают эмбрионы. Для инъекции эмбрионы по мере надобности посредством пониженного давления фиксируют на удерживающей пипетке так, чтобы инъецируемый пронуклеус был хорошо виден. Кончик инъекционной пипетки (внутренний диаметр около 1 мкм) наполняют раствором ДНК. О точности операции судят по набуханию пронуклеуса. После инъекции эмбрионы освобождаются от удерживающей пипетки и культивируют до момента пересадки реципиентам.

Так, в оплодотворенных яйцеклетках мыши или кролика пронуклеусы хорошо видны, их легко инъецировать. У эмбрионов сельскохозяйственных животных в цитоплазме имеются темные липидсодержащие гранулы. Они затрудняют визуализацию пронуклеусов. Поэтому предварительно проводят центрифугирование. При этом гранулы смещаются к одному полюсу яйцеклетки и пронуклеусы становятся видимыми и доступными для микроинъекций.

Затем эмбрионы культивирования in vitro (до нескольких часов) и хирургически трансплантируют в яйцевод синхронизированных реципиентов.

Для образования трансгенных линий животных значение имеет получение таких трансгенных животных, у которых часть половых клеток содержат трансген. Возможно появление мозаик – животных, состоящих из двух или нескольких клеточных линий, происходящих от одной зиготы, но имеющих различные генотипы. Часть мозаиков не может дать начало трансгенным линиям, так как у них отсутствует передача трансгена по наследству.

Чтобы получить одно трансгенное животное, трансген которого был бы включен в геном животного, и оно было способно дать трансгенное потомство, необходимо не менее 100 беременностей после пересадки микроинъецированных эмбрионов.

Эффективность микроинъекций у крупных домашних животных очень низкая.

Пересадка трансфицированных ядер.При этом используются ядра клеток, отобранные на основе трансгенной интеграции, то есть пересаживаются только трансгенные эмбрионы. Поэтому любой новорожденный организм будет трансгенным. Последующая селекция трансгенных эмбрионов не требуется.

Использование сперматозоидов в качестве векторов экзогенного ДНК.При этом сперматозоиды могут быть взяты от одного самца и пересажены в семенники самца того же или другого вида. Там они становятся функционирующими.