Методом Лоури-Лопеца
Принцип метода: Основан на образовании фосфомолибдатного комплекса (Н7[Р(Мо2О7)6] х nН2О), который восстанавливают гидрохиноном и др. до молибденовой сини, колориметрируя затем интенсивность окраски. Белки, мешающие определению Фн, предварительно удаляют из проб общепринятыми способами. Один из самых простых и чувствительных (35-50 нмоль Фн на пробу) – метод Лоури-Лопеца, где восстановитель – аскорбиновая кислота.
Ход работы: 1. За время инкубации системы брожения, каждая рабочая пара студентов маркирует 10 пробирок: 6 – для построения калибровочных проб и еще 4 – для разведенных центрифугатов.
2. В соответствии с таблицей 12.2, в пробирки 1-6 внести указанные объемы основного 10-4 М раствора Na2HPO4 х 2H2O и дистиллята.
Таблица 12.2
Калибровка растворов для определения неорганического фосфата = Фн
3. Получив у дежурных мерные колбы 1 – 4 с разведенными центрифугатами исследуемых проб, отобрать из каждой по 2,7 мл раствора и, соответственно перенести их в пробирки 7 – 10.
4. Получить у лаборанта свежеприготовленные 1 % растворы:
а) молибдата аммония (NH4)Mo7O24 х 4Н2О в 6 н серной кислоте; б) аскорбиновой кислоты в 0,0005 н растворе сульфата меди (CuSO4 х 5H2O).
5. Во все 10 рабочих пробирок добавить по 0,4 мл 1 % раствора молибдата аммония.
6. Точно через 5 мин, также во все пробирки добавить по 0,4 мл 1% раствора аскорбата и, тщательно перемешав пробы, оставить их точно на 20 мин на столе для развития окраски.
7. В соответствии с работой 4.3.1, прогреть ФЭК КФК-2.
8. Фотометрировать все 10 проб против воды, в кюветах на 5 мм и красном светофильтре, занося соответственно, результаты калибровки в таблицу 12.2, а исследуемых проб – в таблицу 12.3 протокола занятия.
9. По аналогии с работой 7.3, на основании данных таблицы 12.3 построить калибровочный график зависимости А = абсорбции раствора от концентрации Фн в пробах.
10. С помощью калибровочного графика и, с учетом разведения проб в 50 раз, рассчитать и внести в таблицу 12.3. концентрации Фн в инкубационной среде.
Таблица 12.3
Динамика убыли ортофосфата в инкубационной среде
в процессе брожения
11. По результатам опыта, построить график динамики убыли фосфата в процессе брожения и сделать выводы.
Дата добавления: 2016-02-16; просмотров: 759;