Испытание ИО на гистамин

2.0. Предварительное испытание

После достижения постоянной величины ответа отрезка кишки на введение СО вразведении 3 проводят испытание ИО на гистамин. Для этого с интервалом не менее 4 мин однократно в случайном порядке вводят СО в разведениях 1 и 3 и неразведенный ИО. Циклы «введение–экспозиция–два отмывания» такие же, как и при проведении адаптации органа к субмаксимальной дозе.

В случае, если пик, полученный в ответ на введение ИО, по высоте не меньше, чем пик СО в разведении 1, проводят количественное определение содержания гистамина в ИО (см. п. 2.1). Если пик, полученный в ответ на введение ИО, меньше пика СО в разведении 1 или вообще отсутствует, проводят контрольное испытание (см. п. 2.2).

2.1. Количественное испытание ИО на гистамин

В случайном порядке поочерёдно вводят СО в разведениях 1и 3 и ИО до получения не менее 4 пиков в ответ на введение каждого раствора. Находят среднее значение ответа отрезка кишки на каждый раствор. С помощью регрессионного анализа вычисляют параметры линейной зависимости среднего ответа кишки на введение СО от логарифма его концентрации. Затем, подставляя полученные значения этих параметров в уравнение регрессии, вычисляют концентрацию гистамина в том разведенииИО, которому соответствует средняя высота его пика, и, исходя из этого, рассчитывают содержание гистамина в неразведённом ИО.

ИО считают прошедшим испытание, если найденное содержание гистамина не превышает максимально допустимое, указанное в нормативной документации (коэффициент пересчёта гистамина дигидрохлорида на гистамин-основание равен 0,6038).

2.2. Контрольное испытание

Схема проведения контрольного испытания такая же, как и при количественном определении содержания гистамина в ИО, только вместо ИО используют СО в разведении 2. Если средняя высота его пика соответствует вводимой концентрации гистамина дигидрохлорида в данном разведении (2,50 10^–6 г/мл), то результаты опыта следует признать достоверными.

Результаты опыта следует признать недостоверными в каждом из следующих случаев:

1. Если средняя высота пика СО в разведении 2 не соответствует вводимой концентрации гистамина дигидрохлорида в данном разведении (2,50 10^–6 г/мл).

2. Если при количественном определении содержания гистамина в ИО отсутствует воспроизводимость ответов отрезка кишки на введение ИО.

3. Если в процессе эксперимента наблюдается статистически значимое снижение высоты пиков в ответ на серию введений одного и того же раствора (примечание 4).

В каждом из этих 3 случаев следует провести испытание ИО на вещества депрессорного действия в соответствии с ОФС «Испытание на депрессорные вещества».

Примечания

1. Гипокальциевый раствор Тироде.

Состав:

· NaCl 80,00 г;

· NaHCO₃ 10,00 г;

· D-глюкоза 11,00 г;

· KCl 2,00 г;

· CaCl₂∙2H₂O 1,30 г;

· MgCl₂∙6H₂O 2,10 г;

· NaH₂PO₄∙H₂O 0,58 г;

· Вода очищенная до 10 л.

Приготовление

В мерном цилиндре вместимостью 1 л растворяют в воде очищенной навески NaCl, NaHCO₃ и D-глюкозы в любом порядке. Доводят объём раствора тем же растворителем до метки, перемешивают и переливают содержимое цилиндра в 10-литровую стеклянную емкость с притёртой пробкой или полиэтиленовый сосуд того же объема с завинчивающейся крышкой.

Таким же образом, но по отдельности, каждую из оставшихся навесок растворяют в 1 л воды очищенной и по очереди переносят в тот же 10-литровый сосуд, строго придерживаясь следующего порядка:

1) KCl,

2) CaCl₂∙2H₂O,

3) MgCl₂∙6H₂O,

4) NaH₂PO₄∙H₂O.

Затем доливают воду очищенную до отметки 10 л и вновь тщательно перемешивают.

Полученный раствор может храниться при температуре от 3 до 5 ºС не более 24 ч. Помутнение недопустимо.

Помутневший раствор следует вылить, тщательно промыть сосуд в проточной воде и прополоскать водой очищенной. Поверхностно активные моющие средства применять нельзя.

2. Сосуд, в котором находятся отрезки подвздошной кишки при хранении, плотно не закрывают, а затягивают двойным слоем марли, чтобы обеспечить доступ воздуха. Перед использованием в опыте отрезки следует подготовить. Для этого сосуд в течение 10 мин держат при комнатной температуре, а затем в течение 20 мин при температуре 35 ºС в термостате. После нагревания из отрезка следует удалить слизь. Это достигается лёгкими поглаживающими движениями в продольном направлении.

3. Струя вводимого раствора должна быть направлена не прямо на изолированный отрезок кишки, а в сторону стенки ванночки, причём направление струи не должно меняться. Скорость введения должна быть максимально высокой и постоянной.

Регистрацию сокращений проводят непрерывно (скорость ленты 2 мм/мин.). В случае использования механического рычага и кимографа писчик во время отмывания можно отводить и прекращать запись.

4. Каждую серию, состоящую не менее чем из 4 пиков, полученных в результате введения одного и того же раствора, следует проверять с помощью теста Нойманна на дрейф:

,

где:

x - высота пика на введение одного и того же раствора;

n - число пиков, полученных в результате введения одного и того же раствора.

Значение D при P = 95 % должно быть:

при n = 4 - меньше 0,78;

при n = 5 - меньше 0,82;

при n = 6 - меньше 0,89.