Питательные среды и растворы
Для испытания качества ЛС на микробиологическую чистоту используют питательные среды отечественного или зарубежного производства.
При приготовлении питательных сред в лаборатории необходимо строго придерживаться приведенной рецептуры, а при использовании коммерческих сухих питательных сред - инструкции предприятия-изготовителя. Входящие в состав питательных сред индикаторы и красители добавляют в виде растворов определенной концентрации. Необходимое значение рН питательной среды устанавливают при температуре (22,5 ± 2,5) оС.
Если нет других указаний в нормативной документации, среды стерилизуют в автоклаве при температуре 121 оС в течение 15 мин, при условии валидации процесса стерилизации.
Фосфатный буферный раствор с натрия хлоридом и пептоном (рН 7,0):
| · Калия фосфат однозамещенный | 3,6 г |
| · Натрия фосфат двузамещенный | 7,2 г |
| · Натрия хлорид | 4,3 г |
| · Пептон (мясной или казеиновый) | 1,0 г |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл |
Нейтрализующая жидкость
| · Твин-80 | 30,0 г |
| · Лецитин (яичный или соевый) | 3,0 г |
| 1,0 г |
| 1,0 г |
| 4,3 г |
| 3,6 г |
| 7,2 г |
| 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,6 ± 0,2 |
Полужидкий агар для хранения тест-микроорганизмов
| · Панкреатический гидролизат казеина | 8,0 г | |
| · Натрия хлорид | 5,0 г | |
| · Агар микробиологический | 5,0 г | |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл | |
| рН после стерилизации | 7,0 ± 0,2 | |
Соево-казеиновый агар (Casein Soya Bean Digest agar)
| · Панкреатический гидролизат казеина | 15,0 г |
| · Папаиновый гидролизат бобов сои | 5,0 г |
| · Натрия хлорид | 5,0 г |
| · Агар микробиологический | 15,0 г |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,3 ± 0,2 |
Альтернативная среда отечественного производства для выращивания аэробных бактерий – среда № 1 для контроля микробной загрязненности, сухая; мясопептонный агар (МПА); агаризованные питательные среды на основе гидролизата рыбной муки (ГРМ).
Бульон Сабуро (Sabouraud Broth)
| · Пептон (мясной) | 5,0 г |
| · Пептон (казеиновый) | 5,0 г |
| · Глюкозы моногидрат | 20,0 г |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 5,6 ± 0,2 |
Агар Сабуро с глюкозой (Sabouraud 4% Glucose Agar )
| · Пептон (мясной или казеиновый) | 10,0 г |
| · Глюкозы моногидрат | 40,0 г |
| · Агар бактериологический | 15,0 г |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 5,6 ± 0,2 |
Альтернативная отечественная среда для выращивания дрожжевых и плесневых грибов – среда № 2 (агар Сабуро с глюкозой) для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.
Для повышения селективности среды с целью предотвращения роста бактерий перед стерилизацией добавляют 50 мг хлорамфеникола (левомицетина) на 1 л среды или перед розливом в чашки Петри в расплавленную среду вносят 0,1 г натриевой соли бензилпенициллина и 0,1 г тетрациклина на 1 л среды в виде стерильных растворов.
Бульон Мосселя для обогащения энтеробактерий (Enterobacteria Enrichment Broth – Mossel)
| · Панкреатический гидролизат желатина | 10,0 г | ||
| · Глюкозы моногидрат | 5,0 г | ||
| · Бычья желчь сухая | 20,0 г | ||
| · Калия фосфат однозамещенный | 2,0 г | ||
| · Натрия фосфат двузамещенный | 8,0 г | ||
| · Бриллиантовый зеленый | 0,015 г | ||
| · Вода очищенная | 1000,0 мл | ||
| рН | 7,2 ± 0,2 | ||
Среду нагревают при температуре 100 °С в течение 30 мин с последующим быстрым охлаждением.
Альтернативная отечественная среда для выращивания аэробных бактерий – среда № 3 для контроля микробной загрязненности, сухая; различных производителей.
Агар Мосселя (Crystal violet, Neutral Red, Bile Agar with Glucose)
| · Дрожжевой экстракт | 3,0 г |
| · Панкреатический гидролизат казеина | 7,0 г |
| · Соли желчи | 1,5 г |
| · Лактозы моногидрат | 10,0 г |
| · Натрия хлорида | 5,0 г |
| · Глюкозы моногидрат | 10,0 г |
| · Агар микробиологический | 15,0 г |
| · Нейтральный красный | 0,03 г |
| · Кристаллический фиолетовый | 0,002 г |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл |
| рН | 7,4 ± 0,2 |
Нагревают до кипения. Среду не автоклавируют.
Альтернативная отечественная среда для выделения энтеробактерий – среда № 4 (Эндо) для контроля микробной загрязненности, сухая; различных производителей.
Бульон Мак-Конки (MacConkey Broth)
| · Панкреатический гидролизат желатина | 20,0 г | ||
| · Лактозы моногидрат | 10,0 г | ||
| · Бычья желчь сухая | 5,0 г | ||
| · Бромкрезоловый пурпурный | 0,01 г | ||
| · Вода очищенная | 1000,0 мл | ||
| рН после стерилизации | 7,3 ±0,2 | ||
Альтернативная отечественная среда обогащения для энтеробактерий – среда № 3 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.
Агар Мак-Конки (MacConkey Agar)
| · Панкреатический гидролизат желатина | 17,0 г | ||
| · Пептон (мясный или казеиновый) | 3,0 г | ||
| · Лактозы моногидрат | 10,0 г | ||
| · Натрия хлорид | 5,0 г | ||
| · Соли желчи | 1,5 г | ||
| · Агар микробиологический | 13,5 г | ||
| · Нейтральный красный | 0,03 г | ||
| · Кристаллический фиолетовый | 0,001 г | ||
| · Вода очищенная | 1000,0 мл | ||
| рН после стерилизации | 7,1 ± 0,2 | ||
Перед стерилизацией кипятят 1 мин, постоянно встряхивая.
Альтернативная отечественная среда для выделения энтеробактерий – среда № 4 (Эндо) для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.
Накопительная среда для бактерий рода Salmonella (бульон Раппопорта – Вассилиадиса)
| · Соевый пептон | 4,5 г |
| · Магния хлорид шестиводный | 29,0 г |
| · Натрия хлорид | 7,2 г |
| · Калий фосфорнокислый двузамещенный | 0,18 г |
| · Калий фосфорнокислый однозамещенный | 1,26 г |
| · Малахитовый зеленый | 0,036 г |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 5,2 ± 0,2 |
Среду автоклавируют в течение 15 мин при температуре 115 оС.
Ксилоза, лизин, дезоксихолат агар (Xylose, Lisine, Deoxycholate Agar)
| · Ксилоза | 3,5 г |
| · L–лизин | 5,0 г |
| · Лактозы моногидрат | 7,5 г |
| · Сахароза | 7,5 г |
| · Натрия хлорид | 5,0 г |
| · Дрожжевой экстракт | 3,0 г |
| · Феноловый красный | 0,08 г |
| · Агар микробиологический | 13,5 г |
| · Натрия дезоксихолат | 2,5 г |
| · Натрия тиосульфат | 6,8 г |
| · Железа аммоний цитрат | 0,8 г |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл |
| рН | 7,4 ± 0,2 |
Доводят до кипения, охлаждают до температуры 50 °С и разливают в чашки Петри. Среду не автоклавируют.
Висмут-сульфитный агар (Bismuth Sulfite agar)
| · Мясной экстракт | 5,0 г |
| · Мясной пептон | 10,0 г |
| · Глюкозы моногидрат | 5,0 г |
| · Натрия фосфат двузамещенный | 4,0 г |
| · Железа сульфат | 0,3 г |
| · Бриллиантовый зеленый | 0,025 г |
| · Висмута сульфит | 8,0 г |
| · Агар микробиологический | 15,0 г |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл |
| рН | 7,6 ± 0,2 |
Среду не автоклавируют. Приготовленная среда непрозрачна, зеленого цвета.
Альтернативная отечественная среда для выделения сальмонелл – среда № 5 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.
Соево-казеиновый бульон (Casein Soya Bean Digest Broth)
| · Панкреатический гидролизат казеина | 17,0 г | ||
| · Папаиновый гидролизат бобов сои | 3,0 г | ||
| · Натрия хлорид | 5,0 г | ||
| · Калия фосфат двузамещенный | 2,5 г | ||
| · Глюкозы моногидрат | 2,5 г | ||
| · Вода очищенная | 1000,0 мл | ||
| рН после стерилизации | 7,3 ± 0,2 | ||
Альтернативная отечественная среда для выращивания бактерий – среда № 8 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.
Цетримидный агар (Cetrimide Agar)
| · Панкреатический гидролизат желатина | 20,0 г | ||
| · Магния хлорид | 1,4 г | ||
| · Калия сульфат двузамещенный | 10,0 г | ||
| · Цетримид (цетилпиридиния бромид) | 0,3 г | ||
| · Агар микробиологический | 13,6 г | ||
| · Глицерин | 10,0 мл | ||
| · Вода очищенная | 1000,0 мл | ||
| рН после стерилизации | 7,2 ± 0,2 | ||
Альтернативная отечественная среда для выделения синегнойной палочки – ЦПХ (среда № 16) – агар для выделения синегнойной палочки, сухая.
ЦПХ агар (среда № 16)
| · Пептон сухой ферментативный | 20,0 г | ||
| · Калий сернокислый | 7,6 г | ||
| · Магний сернокислый семиводный | 2,4 г | ||
| · Сода кальцинированная | 1,0 г | ||
| · Фенозан-кислота | 0,2 г | ||
| · ЦПХ (N-цетилпиридиний хлористый 1-водный) | 0,3 г | ||
| · Агар микробиологический | 8,0 г | ||
| · Вода очищенная | 1000,0 мл | ||
| рН | 7,2 ± 0,2 | ||
Среду не автоклавируют.
Агар для выявления пиоцианина Pseudomonas (Pseudomonas Agar Medium for Detection of Pyocyanin)
| · Панкреатический гидролизат желатина | 20,0 г | ||
| · Магния хлорид безводный | 1,4 г | ||
| · Калия сульфат безводный | 10,0 г | ||
| · Агар микробиологический | 15,0 г | ||
| · Глицерин | 10,0 мл | ||
| · Вода очищенная | 1000,0 мл | ||
| рН после стерилизации | 7,2 ± 0,2 | ||
Все компоненты, кроме глицерина, растворяют в воде. Нагревают при перемешивании и кипятят 1 мин. Добавляют глицерин и стерилизуют.
Альтернативная отечественная среда для идентификации синегнойной палочки – среда № 9 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.
Маннитно-солевой агар
| · Пептон ферментативный сухой | 10,0 г |
| · D-Маннит | 10,0 г |
| · Натрия хлорид | 75,0 г |
| · Агар микробиологический | 15,0 г |
| · Феноловый красный | 0,025 г |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,4 ± 0,2 |
Альтернативная отечественная среда для выделения и идентификации золотистого стафилококка – среда № 10 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.
Трехсахарный агар с солями железа (Triple Sugar–Iron–Agar)
| · Мясной экстракт | 3,0 г |
| · Дрожжевой экстракт | 3,0 г |
| · Пептон (казеиновый или мясной) | 20,0 г |
| · Натрия хлорид | 5,0 г |
| · Лактозы моногидрат | 10,0 г |
| · Сахароза | 10,0 г |
| · Глюкозы моногидрат | 1,0 г |
| · Железо–аммоний цитрат | 0,3 г |
| · Натрия тиосульфат | 0,3 г |
| · Феноловый красный | 0,025 г |
| · Агар микробиологический | 12,0 г |
| · Вода очищенная | 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,4 ± 0,2 |
Среду разливают в пробирки, заполняя их на 1/3 объема. После стерилизации среду оставляют для застывания таким образом, чтобы образовались столбик и скошенная часть над ним.
Альтернативная отечественная среда для идентификации сальмонелл – среда № 13 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.
Цитратный агар Симмонса
| · Натрия хлорид | 5,0 г |
| · Магния сульфат · Аммония дигидрофосфат · Калия гидрофосфат · Натрия цитрат · Бромтимоловый синий · Агар микробиологический · Вода очищенная | 0,2 г 1,0 г 1,0 г 3,0 г 0,08 г 20,0 г 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,2 ± 0,2 |
Альтернативная отечественная среда для идентификации E. coli – среда № 14 для контроля микробной загрязненности, сухая, различных производителей.
Питательный агар с глюкозой
| · Триптический гидролизат казеина с содержанием аминного азота 150 мг % · Экстракт кормовых дрожжей · Агар микробиологический · Глюкоза · Натрия хлорид · Вода очищенная | 150 мл 5,0 г 20,0 г 5,0 г 5,0 г до 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,2 ± 0,2 |
Стерилизация: при температуре 121 °С, 15 мин
Мясопептонный агар (МПА) с 0,5 % глюкозы
| · Мясная вода · Натрия хлорид · Пептон ферментативный сухой · Агар микробиологический · Глюкоза | 1000,0 мл 5,0 г 10,0 г 20,0 г 5,0 г |
| рН после стерилизации | 7,4 ± 0,1 |
Стерилизация: при температуре 121 °С, 15 мин.
Питательный агар с 9 % натрия хлорида (солевой агар)
| · Мясная вода · Натрия хлорид · Пептон ферментативный сухой · Агар микробиологический · Глюкоза | 1000,0 мл 5,0 г 10,0 г 20,0 г 5,0 г |
| рН после стерилизации | 7,4 ± 0,1 |
Питательный агар с 9 % натрия хлорида может быть приготовлен на основе МПА с добавлением 9 % натрия хлорида.
Мясотрипсиновый гидролизат с содержанием аминного азота (0,60 + 0,05) %
| · Мясо (говядина) · Вода питьевая · Железа поджелудочная крупного рогатого скота · Хлороформ · Натрий углекислый кислый | 1000,0 г 2000,0 мл 130,0 г 1000,0 мл 13,0 г |
| рН после стерилизации | 7,4 ± 0,1 |
Стерилизация: при температуре 121 °С 15 мин.
Кровяной агар с добавлением дефибринированной крови
| · 2 % мясопептонный агар · Дефибринированная кровь | 950,0 мл 50,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,4 ± 0,1 |
В расплавленный и охлажденный до температуры 45 °С МПА добавляют дефибринированную кровь (человека, барана, кролика), перемешивают до однородного состояния и разливают по чашкам Петри.
Приготовление дефибринированной крови. Кровь асептически собирают в стерильный сосуд, на дне которого находятся стеклянные бусы, закрывают пробкой и встряхивают 20 – 25 мин до выпадения фибрина; жидкую, не свернувшуюся часть крови, добавляют в нужном количестве к охлажденному до температуры (45 + 2) оС МПА.
Среда с мочевиной
| · Гидролизат казеина, сброженный E. coli М-17 (содержание аминного азота (6,6 ± 0,6 г/ла) ) · Натрия хлорид · Агар микробиологический · Мочевина · Лактоза · Глюкоза · Индикатор комбинированный (Андреде с добавлением 0,35 % бромтимолового синего)б) · Вода очищенная | 80,0 мл 5,0 г 10,0 г 10,0 г 10,0 г 1,0 г 40,0 мл до 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,1 ± 0,1 |
Стерилизация: при температуре 110 оС 15 мин.
а) Приготовление сброженного казеинового гидролизата. Микробную суспензию готовят суспендированием в 0,9 % растворе натрия хлорида 24-часовой культуры E. coli М-17, выращенной на МПА. Полученную микробную суспензию доводят до 10 МЕ мутности по СО. На 1 л казеинового гидролизата добавляют 3 – 5 мл микробной суспензии, инкубируют в течение 24 ч при температуре (37 + 1) оС и стерилизуют.
б) Приготовление комбинированного индикатора Андреде. К 400 мл воды дистиллированной прибавляют 1 г фуксина кислого и 64 мл 1 М раствора натрия гидроксида, выдерживают 1 сут при температуре (37 + 1) оС и 2 сут при комнатной температуре. Хранят в бутыли темного стекла с притертой пробкой при комнатной температуре в защищенном от света месте.
При приготовлении комбинированного индикатора Андреде к 100 мл индикатора Андреде добавляют 350 мг бромтимолового синего.
Среда с мочевиной по Преусу
| · Мясотрипсиновый гидролизат с содержанием аминного азота (0,60 ± 0,05) % а) · Агар микробиологический · Глюкоза · Мочевина (раствор 50 %-ный водный) · Бромтимоловый синий | 1000,0 мл 15,0 г 5,0 г 20,0 мл 12,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,0 ± 0,1 |
Среда Гаузе № 2 агаризованная
| · Бульон Хоттингера с содержанием амминного азота 700 мг% · Пептон сухой · Натрия хлорид · Глюкоза · Агар микробиологический · Вода очищенная | 30,0 мл 5,0 г 5,0 г 10,0 г 30,0 г до 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,2 ± 0,2 |
Бульон Хоттингера
| · Гидролизат Хоттингера · Натрия хлорид · Вода очищенная | 24,0 г 5,0 г до 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,2 ± 0,2 |
Желточно-солевой агар
| · Мясопептонный агар · Натрия хлорид · Желточная взвесь (1 желток на 200 мл 0,9 % раствора натрия хлорида) · Вода очищенная | 850,0 мл 90,0 г 150,0 мл до 1000,0 мл |
| рН после стерилизации | 7,2 ± 0,2 |
Возможно внесение изменений в составы питательных сред и замена материалов животного происхождения компонентами промышленного производства при условии подтверждения качества и валидации их применения для проведения испытаний по показателю «Микробиологическая чистота».
Дата добавления: 2016-01-30; просмотров: 2940;