Метод 5 (колориметрический метод с биуретовым реактивом)

Метод основан на взаимодействии ионов двухвалентной меди с пептидными связями молекулы белка в щелочной среде с образованием окрашенного комплекса, оптическая плотность которого измеряется при длине волны 540 нм. Этот метод показывает минимальные различия между равными количествами иммуноглобулиновых и альбуминовых белков.

Метод не рекомендован для проведения реакции в растворах, содержащих соли аммония, а также для мутных или образующих осадок растворов. Для устранения влияния мешающих веществ проводят осаждение белка из раствора испытуемого образца следующим образом: к 1 объему раствора испытуемого образца прибавляют 0,1 объем трихлоруксусной кислоты раствора 50 %, перемешивают на вихревой мешалке и выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин, центрифугируют при 3000 g в течение 30 мин. Удаляют надосадочную жидкость и растворяют осадок в небольшом объеме натрия гидроксида раствора 0,5 М. Полученный раствор используют для приготовления испытуемого раствора.

При построении калибровочного графика стандартные растворы белка следует обрабатывать аналогичным способом.

Стандартные растворы. Если иное не указано в фармакопейной статье, растворяют соответствующий стандартный образец белка в натрия хлорида растворе 0,9 %. Части полученного раствора разводят натрия хлорида раствором 0,9 % для получения не менее трех стандартных растворов с концентрациями в интервале от 2 до 10 мг/мл.

Испытуемый раствор. Готовят раствор испытуемого лекарственного средства в натрия хлорида растворе 0,9 % с концентрацией белка, находящейся в пределах интервала концентраций стандартных растворов.

Контрольный раствор. Используют натрия хлорида раствор 0,9 %.

Методика. К 1,0 мл испытуемого раствора, каждого из стандартных растворов и контрольного раствора прибавляют 4,0 мл биуретового реактива, перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 30 мин. Измеряют оптическую плотность испытуемого и стандартных растворов при длине волны 540 нм, используя контрольный раствор в качестве раствора сравнения (или при указанной в фармакопейной статье длине волны в пределах 540 - 650 нм).

Зависимость оптической плотности от концентрации белка носит нелинейный характер. Однако в небольшом интервале концентраций, используемых для построения калибровочного графика, она приближается к линейной. Строят график зависимости оптических плотностей стандартных растворов от концентраций белка и используют линейную регрессию для построения калибровочной кривой. На основании калибровочной кривой и оптической плотности испытуемого раствора определяют концентрацию белка в испытуемом растворе.

Калибровочный график строят каждый раз при приготовлении новых реактивов или при использовании другого спектрофотометра, но не реже 1 раза в 3 мес.

Примечание.

Приготовление трихлоруксуснойкислоты раствора 50 %. В мерную колбу вместимостью 500 мл помещают 250 г трихлоруксуснойкислоты и растворяют в воде. Объем раствора доводят до метки водой и тщательно перемешивают.

Срок годности трихлоруксусной кислоты раствора 50 % 1 мес.

Метод 6 (флуорометрический метод с о-фталальдегидом)

Метод основан на дериватизации белка о-фталальдегидом, который реагирует с первичными аминогруппами белка (N-концевая аминокислота и
ε-аминогруппа остатков лизина), с последующим измерением флуоресценции полученного комплекса. Чувствительность количественного определения может быть увеличена гидролизом белка перед добавлением о-фталальдегида. Гидролиз делает α-аминогруппу, входящую в структуру аминокислот, доступной для взаимодействия с фталальдегидным реактивом. Метод является высокочувствительным и требует небольшого количества белка.

Определению мешают буферные растворы, содержащие первичные амины, такие как трис(гидроксиметил)аминометан, и аминокислоты, которые взаимодействуют с о-фталальдегидом. Аммиак в больших концентрациях также взаимодействует с о-фталальдегидом. Флуоресценция, полученная при взаимодействии аминов с о-фталальдегидом, может быть нестабильной. Использование автоматизированных методик для стандартизации данного метода позволяет повысить точность и воспроизводимость определения.

Стандартные растворы. Растворяют соответствующий стандартный образец белка в натрия хлорида растворе 0,9 %. Части полученного раствора разводят натрия хлорида раствором 0,9 % для получения не менее 5 стандартных растворов с концентрациями в интервале от 10 до 200 мкг/мл. Доводят значение рН раствора до 8,0 – 10,5 перед добавлением фталальдегидного реактива.

Испытуемый раствор. Готовят раствор испытуемого лекарственного средства в натрия хлорида растворе 0,9 % с концентрацией белка, находящейся в пределах интервала концентраций стандартных растворов. Доводят значение рН раствора до 8,0– 10,5 перед добавлением фталальдегидного реактива.

Контрольный раствор. Используют натрия хлорида раствор 0,9 %.

Методика. Смешивают 10 мкл испытуемого раствора, каждого из стандартных растворов и контрольного раствора с 0,1 мл фталальдегидного реактива и выдерживают при комнатной температуре в течение 15 мин. Прибавляют 3 мл натрия гидроксида раствора 0,5 М и перемешивают. Определяют интенсивность флуоресценции испытуемого раствора и каждого из стандартных растворов при длине волны возбуждения 340 нм и длине волны испускания между 440 и 455 нм, используя контрольный раствор в качестве раствора сравнения. Измеряют интенсивность флуоресценции указанных растворов только один раз, поскольку излучение снижает интенсивность флуоресценции.

Зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации белка носит линейный характер. Строят график зависимости интенсивностей флуоресценции стандартных растворов от концентраций белка и используют линейную регрессию для построения калибровочной кривой. На основании калибровочной кривой и интенсивности флуоресценции испытуемого раствора определяют концентрацию белка в испытуемом растворе.

Калибровочный график строят каждый раз при приготовлении новых реактивов или при использовании другого спектрофлуориметра, но не реже 1 раза в 3 мес.

Примечания.

Приготовление боратного буферного раствора. В мерную колбу вместимостью 1000 мл помещают 61,83 г борной кислоты, растворяют в воде и доводят рН до значения 10,4 при помощи раствора калия гидроксида. Объем раствора доводят до метки водой и тщательно перемешивают.

Приготовление исходного раствора фталальдегида. 1,20 г фталальдегида растворяют в 1,5 мл метанола, прибавляют 100 мл боратного буферного раствора и перемешивают. Прибавляют 0,6 мл макрогол 23 лаурилового эфира раствора 30 % (300 г/л) и перемешивают.

Хранят при комнатной температуре и используют в течение 3 недель.

Приготовление фталальдегидного реактива. К 5 мл исходного раствора фталальдегида прибавляют 15 мкл 2-меркаптоэтанола. Раствор следует готовить не менее чем за 30 мин перед использованием.

Используют в течение 24 ч.