Метод 4 (метод с бицинхониновой кислотой, колориметрический)

Метод основан на восстановлении ионов меди Cu²⁺ до ионов меди Cu¹⁺ при взаимодействии с остатками цистеина, цистина, триптофана, тирозина пептидной связью белка и образовании окрашенного комплекса Cu⁺ с бицинхониновой кислотой (2,2’-бихинолин-4,4’-дикарбоновая кислота). Определению мешают восстанавливающие вещества: сахара, аскорбиновая кислота, тиоловые соединения, этилендиаминтетраацетат. Влияние мешающих веществ может быть минимизировано путем разведения, обеспечивающего концентрацию белка на уровне, достаточном для проведения точных измерений. В качестве альтернативы можно использовать методику осаждения белка, описанную в определении белка по методу Лоури. Поскольку интенсивность окраски образующегося комплекса зависит от природы белка, белок стандартного образца должен быть тот же, что и в испытуемом образце.

Стандартные растворы. Соответствующий стандартный образец белка растворяют в буферном растворе, указанном в фармакопейной статье. Части полученного раствора разводят в том же буферном растворе для получения не менее чем 5 стандартных растворов, имеющих концентрации белка, равномерно распределенные в интервале между 10 и 1200 мкг/мл.

Испытуемый раствор. Готовят раствор испытуемого лекарственного средства в буферном растворе, указанном в фармакопейной статье, с концентрацией белка, находящейся в пределах интервала концентраций калибровочного графика.

Контрольный раствор. Используют буферный раствор, применяемый для приготовления стандартных и испытуемого растворов.

Методика. Прибавляют к 0,1 мл каждого стандартного раствора, испытуемого раствора и контрольного раствора 2,0 мл реактива медно- бицинхониновой кислоты. Растворы выдерживают при температуре 37 ºС в течение 30 мин, засекают время и охлаждают смесь до комнатной температуры. Через 60 мин после окончания инкубации при 37 ºС измеряют оптические плотности стандартных растворов и испытуемого раствора на спектрофотометре при длине волны 562 нм в кварцевых кюветах, используя контрольный раствор в качестве раствора сравнения.

Зависимость оптической плотности от концентрации белка носит нелинейный характер, тем не менее, если интервал концентраций, используемых для построения калибровочного графика, небольшой, она приближается к линейной. Строят зависимости оптических плотностей стандартных растворов от концентраций белка и используют линейную регрессию для построения калибровочной кривой. На основании калибровочной кривой и оптической плотности испытуемого раствора определяют концентрацию белка в испытуемом растворе.

Примечания.

1. Приготовление реактива бицинхониновой кислоты. В мерную колбу вместимостью 1 л помещают 10 г динатриевой соли бицинхониновой кислоты, 20 г натрия карбоната моногидрата, 1,6 г натрия тартрата, 4 г натрия гидроксида, 9,5 г натрия гидрокарбоната, растворяют в воде. При необходимости значение рН полученного раствора доводят до 11,25 натрия гидроксида раствором 10 % или натрия гидрокарбоната раствором 5 %. Доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.

2. Приготовление реактива медно-бицинхониновой кислоты. Смешивают 1,0 мл меди сульфата раствора 4 % (40 г/л) и 50,0 мл реактива бицинхониновой кислоты.