Метод Къельдаля (обратное титрование)
А.После минерализации образца лекарственного средства (методы 1 или 2) в приемник помещают точно отмеренное количество (от 10,0 до 25,0 мл) взятой в избытке хлористоводородной или серной кислоты (объем и молярная концентрация раствора кислоты зависят от содержания азота в препарате; указывают в фармакопейной статье).
По окончании отгонки аммиака содержимое приемника титруют натрия гидроксида раствором 0,1 М (или 0,01 М, что должно быть указано в фармакопейной статье) в присутствии смешанного индикатора (если не указано иначе в фармакопейной статье) до перехода окраски из красно-фиолетовой в зеленую.
Проводят контрольный опыт таким же образом и с теми же реактивами, но без испытуемого образца или с использованием 0,050 г глюкозы, о чем должно быть указано в фармакопейной статье.
Содержание азота в лекарственном средстве в процентах (Х1) или в мг/мл (Х2) вычисляют по формулам:
(V0 – V1) ∙ K ∙ Т ∙ 10-3 ∙ 100
Х1 = ––––––––––––––––––––––––,
а
(V0 – V1) ∙ K ∙ Т
Х2 = –––––––––––––––,
V
где: V0 – объем 0,1 М раствора натрия гидроксида, израсходованный на титрование контрольного раствора, мл;
V1 – объем 0,1 М раствора натрия гидроксида, израсходованный на титрование испытуемого раствора, мл;
K – поправочный коэффициент к титру раствора натрия гидроксида;
Т – 1,401 мг/мл – титр 0,1М раствора гидроксида натрия по азоту;
а – навеска образца лекарственного средства, г;
V – объем раствора, взятый для анализа, мл.
Б. Данный метод применяют преимущественно в препаратах крови. В колбу Къельдаля с помощью калиброванной пипетки вносят 0,5 – 1,0 мл испытуемого раствора, содержащего 8 – 32 мг азота (или 50 – 200 мг белка), затем вносят растертую смесь (около 1 г) калия сульфата и меди сульфата (3:1) и от 2 до 4 мл серной кислоты концентрированной в зависимости от содержания белка. Содержимое колбы кипятят. Для ускорения сжигания несколько раз прибавляют по 5 капель концентрированного раствора водорода пероксида и продолжают кипятить, пока раствор не станет голубым или бесцветным. По окончании сжигания смесь охлаждают. В парообразователь наливают воду, нагревают до кипения и проверяют аппарат на герметичность. Присоединяют колбу Къельдаля к прибору для определения азота или количественно переносят содержимое колбы в реакционный сосуд прибора, используя 30 мл воды. Отгон собирают в приемник, куда предварительно наливают от 10,0 до 25,0 мл серной кислоты раствора 0,05 М в зависимости от содержания белка. Приемник присоединяют так, чтобы нижний конец трубки холодильника был опущен в раствор. Воду в парообразователе нагревают до кипения. В колбу Къельдаля или в реакционный сосуд прибора с минерализатом через воронку прибавляют около 20 мл натрия гидроксида раствора 15 М до появления коричневой окраски минерализата. После этого быстро и герметично закрывают зажим воронки и отгоняют аммиак в течение 5 мин. Затем опускают приемник с серной кислоты раствором 0,05 М так, чтобы нижний конец трубки холодильника не касался поверхности жидкости, и продолжают перегонку еще 5 мин. Отгон титруют натрия гидроксида раствором 0,1 М до перехода сиреневой окраски в зеленую (индикатор – 0,05 мл смешанного индикатора). Параллельно проводят контрольный опыт.
1 мл натрия гидроксида раствора 0,1 М соответствует 1,401 мг азота.
Рисунок – Прибор для определения азота.
1 – парообразователь; 2 – предохранительная трубка; 3 – колба Къельдаля; 4 – воронка; 5 – кран или зажим; 6 – брызгоуловитель; 7 – холодильник; 8 – колба-приемник
Определение белка
Определение содержания белка проводят в лекарственных средствах, выделенных из природных источников или полученных биотехнологическими методами.
Для таких лекарственных средств могут использоваться модифицированные методики определения белка, указанные в фармакопейных статьях, в которых могут быть изменены рекомендуемые области концентраций белка и/или объемы испытуемого раствора и реактивов и некоторые другие условия в соответствии с индивидуальными свойствами определяемого компонента.
Колориметрические и некоторые спектрофотометрические методы требуют использования стандартного образца. В качестве стандартного образца белка используют: стандартный образец присутствующего в препарате белка или бычий сывороточный альбумин, или сывороточный альбумин человека, высушенные перед испытанием до постоянной массы (стандартный образец и условия высушивания указывают в фармакопейной статье).
Для количественного определения белка используют спектрофотометрические, колориметрические и спектрофлуориметрические методы.
Метод 1 (спектрофотометрический)
Метод основан на способности ароматических аминокислот (тирозина, триптофана и, в меньшей степени, фенилаланина), входящих в последовательность молекулы белка, поглощать ультрафиолетовый (УФ) свет при длине волны около 280 нм.
Для растворения молекул белка используют различные растворители: воду, натрия хлорид раствор 0,9 %, различные буферные растворы и др.
Если буферный раствор, используемый для растворения белка, обладает значительным светопоглощением по отношению к воде, в нём присутствует вещество, мешающее определению. Эта интерференция может быть устранена использованием самого буферного раствора в качестве раствора сравнения. В том случае, если вещество, мешающее определению, обладает большой оптической плотностью, достоверность результатов определения может вызывать сомнения.
При низких концентрациях белок адсорбируется на стенках кюветы, что может приводить к заниженным результатам содержания белка в растворе. В этом случае испытуемый раствор препарата предварительно концентрируют или используют при приготовлении испытуемого раствора неионные детергенты.
Испытуемый раствор. Готовят раствор испытуемого вещества в буферном растворе, указанном в фармакопейной статье, с концентрацией белка от 0,2 до 2,0 мг/мл.
Стандартный раствор. Готовят раствор соответствующего стандартного образца в том же буферном растворе и с той же концентрацией белка, что и в испытуемом растворе.
Методика. Испытуемый раствор, стандартный раствор и раствор сравнения выдерживают при одинаковой температуре. Температуру и время инкубации указывают в фармакопейной статье. Определяют оптические плотности испытуемого и стандартного растворов в кварцевых кюветах при длине волны 280 нм, используя тот же буферный раствор в качестве раствора сравнения.
Для получения достоверных и точных результатов значения оптической плотности растворов должны удовлетворять требованиям линейности в интервале определяемых концентраций белка.
Для высокоочищенных белков концентрацию белка в растворе вычисляют с использованием удельного показателя поглощения.
Рассеяние света. Точность определения содержания белка в УФ области снижается, если белки в растворе существуют в виде частиц, сравнимых по размеру с длиной волны измеряемого света (250 – 300 нм). Рассеяние светового потока приводит к увеличению оптической плотности испытуемого раствора. При расчете оптической плотности испытуемого раствора при длине волны 280 нм, обусловленной рассеянием света, определение проводят при длинах волн 320, 325, 330, 335, 340 и 350 нм. Строят график зависимости десятичного логарифма (lg) оптической плотности от lg соответствующей длины волны. Экстраполируют кривую методом линейной регрессии для определения логарифма оптической плотности при длине волны 280 нм. Антилогарифм этого значения соответствует оптической плотности за счет рассеяния света. Для расчета истинного содержания белка в испытуемом растворе оптическую плотность раствора, полученную при 280 нм, корректируют, вычитая оптическую плотность, относящуюся к рассеянному свету.
Снизить эффект рассеянного света в опалесцирующих растворах можно фильтрованием через фильтр с размером пор 0,2 мкм, не адсорбирующим белок, или центрифугированием. Условия фильтрования и центрифугирования указывают в фармакопейной статье.
Расчеты. Концентрацию белка в испытуемом растворе (С) в мг/мл вычисляют по формуле:
С = С0 ∙ А/А0,
где С0 - концентрация белка в растворе стандартного образца, мг/мл;
А и А0 – скорректированные значения оптической плотности испытуемого раствора и раствора стандартного образца соответственно.
Дата добавления: 2016-01-30; просмотров: 1812;