Как можно судить о начале работы генов

Начало работы генов, точнее, их экспрессию можно заметить по проявлению отцовских признаков, если эти признаки отличаются от материнских. Действительно, когда у зародыша появляются черты, присущие отцовскому организму, но отсутствующие у материнского, не остается сомнений, что отцовские гены начали работать (одновременно с ними обычно начинают работать и гены в хромосомах, полученных от матери). Трудность тут состоит в том, что обычно признаки, отличающие двух животных одного вида (например, окраска), проявляются только на поздних стадиях, когда мы и без того знаем, что гены давно уже начали работать.

Эту трудность можно частично преодолеть, если использовать межвидовые, межродовые и даже межсемейственные гибриды, у которых отличия родительских организмов были бы достаточно велики и могли бы проявляться на более ранних стадиях. Получение отдаленных гибридов хорошо удается у морских ежей, у рыб, хуже – у птиц и почему‑то совсем плохо у амфибий. Во всех опытах, проведенных на гибридах, было показано, что их развитие начинается неотличимо от развития материнского организма. Этого и следовало ожидать: ведь на самых ранних стадиях гены, в том числе и отцовские, еще не работают. Отцовские признаки проявляются обычно позже – у более дифференцированных зародышей или даже только у ранней личинки.

Этот метод имеет тот очевидный недостаток, что эмбриональное развитие даже довольно далеких видов обычно протекает очень похоже и на ранних стадиях бывает трудно отыскать видовые или родовые различия. Кроме этого, при отдаленной гибридизации нет полной уверенности в том, что гены, находящиеся в различных (отцовских и материнских) хромосомах, будут включаться одновременно. Поэтому более надежные данные о начале функционирования генов были получены при изучении летальных гибридов.

При скрещивании далеких видов, даже если оплодотворение и произошло, дальнейшее развитие часто протекает ненормально и в результате заканчивается ранней или поздней гибелью. Такие гибриды называются летальными. При изучении многих летальных гибридов рыб и особенно амфибий было показано, что их развитие останавливается на одной и той же ранней стадии – поздней бластуле. Через определенное время гибридные зародыши, так и не преодолев эту стадию, погибают, очевидно, из‑за каких‑то несоответствий в работе отцовских генов в чужой им материнской цитоплазме. Важно, что, исследовав десятки гибридных комбинаций, никому не удалось обнаружить гибриды рыб или амфибий, у которых развитие останавливалось бы ранее поздней бластулы. На этой стадии гены рыб и амфибий определенно начинают работать. Ho выяснить в таких опытах, не произошла ли активация генов раньше, невозможно. Дело в том, что остановка развития – это типичное проявление морфогенетической функции ядер, т. е. экспрессия их генов. Очевидно, что их функционирование начинается несколько раньше остановки развития.

Рассмотрим в этой связи наши опыты с гибридами рыб. Если яйца вьюна оплодотворить спермиями рыб из других родов и семейств, но того же отряда карпообразных, то их развитие вначале идет нормально, но потом все более отклоняется от нормы. Тем не менее из таких гибридных зародышей выклевываются подвижные, хотя и уродливые личинки, которые погибают через несколько дней. Эти опыты ничего не могут сказать о том, когда происходит активация ядер зародыша, так как, раннее развитие таких гибридов внешне идет нормально и влияние отцовских генов обнаружить трудно. Однако эти эксперименты можно модифицировать. Если до оплодотворения яйца вьюна облучить высокой дозой рентгеновской радиации (10–20 тыс. рад), то их ядра будут разрушены, в то время как цитоплазма практически не пострадает. При оплодотворении таких яиц спермиями своего вида образуются андрогенетические (андрос – мужской) гаплоидные зародыши. Они содержат материнскую цитоплазму и отцовское гаплоидное ядро. Такие зародыши будут развиваться нормально, хотя все личинки в конце концов погибнут, так как гаплоиды нежизнеспособны.

Иной результат получается, если облученные, т. е. фактические безъядерные, яйца вьюна оплодотворить спермиями других видов рыб. При этом образуются андрогенетические гаплоидные гибриды, у которых цитоплазма яйца принадлежит вьюну, а гаплоидные ядра – другому, отцовскому виду. Мы использовали спермин золотой рыбки, барбуса, данио рерио и других аквариумных рыб. И во всех этих случаях развитие доходило только до стадии поздней бластулы, останавливалось и через некоторое время зародыши погибали. Это означает, что гены одного вида не способны обеспечить развитие в чужой цитоплазме. Однако время гибели разных гибридов оказалось неодинаковым: одни погибали почти сразу же после остановки развития, другие жили еще несколько часов. Для каждой гибридной комбинации было свое характерное время выживания. Так как цитоплазма у всех этих зародышей была одна и та же, то очевидно, что время их жизни зависело от активности чужеродных ядер.

Опыты показали, что чужеродные гены, оказавшись в цитоплазме вьюна, все же функционируют и начинают свою работу не позже стадии поздней бластулы.

Есть и более простой способ узнать о начале экспрессии генов зародыша. Если облучить яйцо рентгеновыми лучами уже после оплодотворения, то убиты будут оба ядра – и мужское и женское. Можно также оплодотворить облученное яйцо облученными спермиями. Результат был везде совершенно одинаков: развитие таких безъядерных зародышей всегда останавливалось на стадии поздней бластулы, перед самой гаструляцией.

Очевидно, что развитие безъядерного яйца может происходить только до той стадии, до какой оно было обеспечено запасом белков и мРНК, синтезированных в оогенезе. Остановка развития таких зародышей, по‑видимому, наступит как раз тогда, когда возникает необходимость в новых белках, синтезированных на новых мРНК, транскрибированных не в оогенезе, а уже в собственных ядрах зародыша. Эти результаты не оставляют сомнений в том, что именно гаструляция является первым проявлением активности генов у рыб и амфибий.

Иные результаты были получены, однако, при инактивации ядер у других типов и классов животных. Кроме действия высоких доз радиации, инактивация генетического аппарата может быть эффективно достигнута действием специфических веществ, подавляющих транскрипцию, – актиномицина D или а‑аманитина. Подавление транскрипции в яйцах морского ежа, вызванное этими веществами или радиацией, приводит к остановке развития на более ранних стадиях, чем у рыб и амфибий, – уже во время ранней – средней бластулы. У представителя моллюсков – большого прудовика развитие останавливается на стадии 16 клеток, у круглого червя аскариды – на стадии двух – четырех бластомеров. Опыты, проведенные на зародышах мыши, показали, что ингибиторы синтеза РНК или большие нехватки хромосом приводят

у млекопитающих к очень ранней остановке развития – после двух первых делений.

Перечисленные примеры показывают, что экспрессия генома зародыша в каждой группе животных начинается на своей стадии. В маленьких яйцах (моллюски, круглые черви, млекопитающие) это всегда более ранние стадии, чем в больших (амфибии, рыбы).

Эти опыты, как мы уже говорили, позволяют обнаружить только начало проявления морфогенетической функции ядер. Можно ли выяснить, на какой именно стадии начинается само функционирование генома? Ведь эти два события могут разделять минуты или даже часы. Метод для решения этой задачи был предложен нами уже много лет назад. И хотя с тех пор появились новые, более прямые подходы, этот метод сохранил свое значение и используется в некоторых работах. Опыты были проведены на яйцах вьюна. Здесь хочется сказать несколько слов об этом прекрасном объекте. Роль объекта к биологии может быть очень важна. Вспомним, что законы генетики были открыты на горохе и на дрозофиле, и трудно сказать, па сколько лет задержалось бы развитие этой пауки, если бы выбор объектов оказался менее удачен.

Классическим объектом эмбриологии всегда считалась лягушка. Сейчас особенно широко используют африканскую шпорцевую лягушку – ксенопуса. Развитие экспериментальной эмбриологии рыб явно отстает и, как нам кажется, во многом из‑за того, что не было найдено подходящего объекта.

Когда в нашей лаборатории были начаты первые эксперименты на зародышах вьюна, мы убедились в его необыкновенных достоинствах. Возможность получать и хранить этих неприхотливых рыб круглый год и круглый год получать от них икру, прозрачность ее оболочек, разработанный нами метод отделять зародыш от желтка и культивировать в солевой среде, наконец, возможность использовать таких зародышей для изотопных исследований – вот лишь краткий перечень достоинств вьюна как эмбриологического объекта. Поэтому вьюн сейчас широко используется в различных исследованиях в нашей стране и в странах Восточной Европы, т. е. в тех странах, где он обитает.

Если высокой дозой рентгеновской радиации (20 тыс. рад) инактивировать ядра яиц вьюна тотчас после оплодотворения, то развитие, как мы уже знаем, пойдет внешне нормально только до стадии поздней бластулы, на которой оно остановится. У вьюна при температуре 21 °C стадия поздней бластулы наступает через 9 ч после оплодотворения, и эту стадию удобно так и называть – «стадия 9 часов», всегда имея в виду температуру 21 °C. Если инактивацию ядер произвести через 1 или через 2 ч после оплодотворения, все произойдет точно так же: развитие блокируется на стадии 9 часов, т. е. на поздней бластуле. Это наступит соответственно через 8 или через 7 ч после инактивации ядер. Даже если мы облучим зародышей уже на стадии ранней или средней бластулы, т. е. после 4 или 6 ч нормального развития, остановка все равно произойдет на стадии 9 часов, т. е. через 5 или через 3 ч после облучения. Это означает, что запас белков и мРНК, синтезированных в оогенезе вьюна, достаточен на первые 9 ч развития и этот запас не возрастает за первые шесть часов, а как бы постепенно тратится. Имел ли зародыш неповрежденные ядра только 1 или все первые 6 ч развития, никакой роли не играет: результат будет все тот же – остановка на стадии 9 часов.

Результат этих опытов может быть истолкован только одним образом: в первые 6 ч развития ядра зародыша не осуществляют морфогенетической функции. В это время они активно делятся и соответственно в них синтезируется ДНК. В них в принципе могло бы даже синтезироваться немного РНК, но такие ее виды, которые морфогенеза (конкретно гаструляции) не определяют.

Иной результат получается, если зародыш облучить рентгеновской радиацией и инактивировать в нем ядра в конце стадии средней бластулы, через семь часов после начала развития. Такие зародыши явно начинают гаструляцию и останавливаются на стадии ранней гаструлы, приблизительно эквивалентной 12–13 ч развития. Инактивация ядер через 8 ч после оплодотворения блокирует развитие на еще более поздней стадии –16–17 ч, когда гаструляция близка к завершению. Наконец, действие радиации на стадии 9 часов останавливает развитие уже после завершения гаструляции. Следовательно, позволив ядрам работать в течение всего 3 ч (от 6 до 9 ч), мы как бы предопределили последующее развитие на 8–9 ч вперед.

Эти опыты показали, что морфогенетическая функция ядер начинает осуществляться со стадии средней бластулы или, точнее, через 6 ч после оплодотворения. Это на 3 ч раньше, чем ее первое проявление (поздняя бластула – 9 ч). Все другие методы, о которых речь шла выше, действительно не позволяли судить о начале работы генов.

Точнее всего определить момент начала ядерной активности можно по начавшемуся синтезу РНК. Этот метод не только дает возможность установить, на какой стадии включаются гены зародыша, но и позволяет узнать, какие именно РНК образуются – рРНК, тРНК или мРНК. Более того, в некоторых случаях мы можем сказать, входят ли в состав вновь синтезированных мРНК интересующие нас индивидуальные мРНК, например гистоновые, т. е. мы можем узнать, какие гены начали работать. Однако нам неизвестно, какие мРНК кодируют белки, определяющие морфогенез. Поэтому судить о начале работы генов, определяющих морфогенез, мы можем пока только при помощи метода инактивации ядер на последовательных стадиях развития.