Ооплазматическая сегрегация

Этим термином обозначают возникновение различий между разными частями цитоплазмы яйца (ооплазмы), разделение (сегрегацию) яйца на зоны с несколько различными свойствами. Обычно ооплазматической сегрегацией называют те перемещения компонентов цитоплазмы, которые происходят после оплодотворения и до начала дробления яйца. В действительности же многие процессы ооплазматической сегрегации осуществляются еще в оогенезе, а некоторые продолжаются и в ходе первых делений дробления.

Простейшая ооплазматическая сегрегация происходит в яйцах морского ежа. После четырех делений дробления бластомеры отличаются по способности образовывать некоторые структуры зародыша (султан на анимальном полюсе и кишку на вегетативном). Эта способность меняется вдоль анимально‑вегетативной оси. Такое постепенное изменение свойств яйца называют градиентами. У некоторых видов морских ежей эти градиенты проявляются в виде распределения пигментных гранул, располагающихся близко к одному полюсу или образующих кольцо в области экватора.

Более сложно выглядит ооплазматическая сегрегация в яйце амфибий. Еще в ооците создается неравномерное распределение желтка и пигмента вдоль анимально‑вегетативной оси: желтка больше на вегетативном полюсе, пигмент покрывает анимальную половину яйца. Ядро оплодотворенного яйца сильно сдвинуто к анимальному полюсу и окружено цитоплазмой, свободной от желтка. После оплодотворения происходит дальнейшая сегрегация: на одной из сторон яйца (она станет спинной стороной) в области экватора возникает более светлая область – серый серп (будущая хордо‑мезодерма). Внутри яйца происходят и другие перемещения. В итоге в яйце амфибий можно различать три различно окрашенные зоны: пигментированную анимальную, или эктодермальную; светлую вегетативную, или энтодермальную; экваториальную кольцевую, более широкую в области серого серпа, – мезодермальную. Если до оплодотворения яйцо имело только одну анимально‑вегетативную ось, то теперь в нем можно провести и перпендикулярную ей дорсовентральную ось от спины к животу. Две оси образуют плоскость симметрии, которая делит будущий зародыш на правую и левую половины.

В яйце асцидий до оплодотворения никакой сегрегации не обнаруживается: яйцо можно разрезать пополам в любой плоскости и половина, содержащая ядро, образует нормальный зародыш. Такое яйцо изотропно. После оплодотворения в яйце происходят сложные перемещения, которые удается видеть благодаря наличию в цитоплазме различно окрашенных гранул. В итоге в яйце асцидий можно различить не менее четырех зон – анимальную, вегетативную и две серповидные различно окрашенные области, лежащие на уровне экватора друг против друга.

Очень сложные перемещения происходят в яйцах моллюсков. После оплодотворения на вегетативном полюсе образуется так называемая полярная плазма, которая затем движется вдоль поверхности яйца к анимальному полюсу. У некоторых морских моллюсков ооплазматическая сегрегация выражается еще драматичнее: перед первым делением дробления на вегетативном полюсе временно выпячивается особый вырост – полярная лопасть, которая в ходе первого деления достается одному из двух бластомеров, а после второго деления – одному из четырех. В состав этой лопасти попадает полярная плазма и значительная часть митохондрий яйца.

У морских кишечнополостных – гребневиков оплодотворенные яйца имеют у поверхности зеленый слой – эктоплазму, которая в начале дробления равномерно попадает во все бластомеры. Однако в результате последующих делений образуются две группы клеток: одни из них содержат только эктоплазму, другие лишены ее.

Приведенные здесь примеры относятся к тем случаям, когда за ооплазматической сегрегацией можно следить визуально благодаря различной окраске цитоплазматических компонентов. Ho, наверное, чаще – у большинства видов морских ежей, у костистых рыб, птиц и т. д. – ее просто не видно, хотя она, по всей вероятности, существует. Например, яйцо дрозофилы, как и других насекомых, почти не обнаруживает признаков ооплазматической сегрегации, если не считать особых гранул (половых детерминантов), находящихся на заднем конце яйца. Мы уже говорили, как они определяют судьбу ядер, попавших в эту часть яйца. Почти все остальные ядра – после восьми делений их около 250 – перемещаются из центра яйца к его поверхности, где образуют бластодерму. В это время, как было показано экспериментально, определяется их судьба и ядра, попавшие в определенные зоны поверхностной цитоплазмы, образуют клетки так называемых имагинальных дисков. Из каждого диска (они парные) впоследствии образуются определенные органы взрослой мухи (имаго – взрослая). Поэтому можно утверждать, что цитоплазма поверхности яйца неоднородна и что, хотя она вся внешне выглядит одинаково, в действительности в оогенезе происходит ооплазматическая сегрегация, в ходе которой и возникают различные по свойствам зоны цитоплазмы. Некоторые ядра остаются в центре яйца и образуют специальные желточные клетки.

Из сказанного здесь уже ясен смысл ооплазматической сегрегации: создавая первичные различия в составе цитоплазмы, она в результате делений дробления приводит к образованию клеток, отличающихся по составу цитоплазмы. А это, в свою очередь, определяет их дальнейшую судьбу. Таким образом, ооплазматическая сегрегация является первым фактором, создающим исходные различия между клетками, или, иначе, первым (по времени) фактором дифференцировки.

Роль ооплазматической сегрегации доказывается не только описательно, когда различно окрашенные зоны яйца (там, где эти зоны можно видеть и проследить их судьбу) образуют в нормальном развитии строго определенные зачатки зародыша и затем органы. Экспериментальный метод доказательства обычно состоит в разделении ранних зародышей, на стадии двух, четырех и более клеток, на отдельные бластомеры или на их группы и затем в наблюдении за их судьбой. Возвратимся к приведенным выше примерам.

Если яйцо морского ежа на стадии восьми бластомеров разделить на две или четыре части в плоскости анимально‑вегетативной оси, то из каждой части, состоящей из четырех или двух клеток, разовьется нормальный зародыш. Если же такой зародыш разделить на две части по экватору, то образуются два ненормальных зародыша: один будет лишен кишки, которая образуется у вегетативного полюса, а другой – султана из длинных ресничек, который расположен с анимальной стороны. Более детальные эксперименты с разделением 16‑клеточного зародыша и комбинацией разных клеток показали, что «анимальные» свойства постепенно падают вдоль оси яйца, а навстречу ей так же постепенно нарастают «вегетативные» свойства. Речь, очевидно, идет о градиентах концентраций каких‑то веществ или структур вдоль анимально‑вегетативной оси.

У амфибий судьба двух разделенных бластомеров зависит от того, как прошла плоскость первого деления. Если она прошла через серый серп и разделила его на две, пусть неравные, части, то оба изолированных бластомера разовьются в нормальных зародышей. Но если случайно первая плоскость деления оставила весь серый серп в одном бластомере, то только он даст нормального зародыша. Другие разнообразные эксперименты показали, что три зоны яйца определяют образование трех зародышевых листков.

В последние годы, однако, получены новые данные, которые говорят о том, что у амфибий первично возникают только две зоны – анимальная и вегетативная, а промежуточная между ними – будущая мезодерма – появляется позже как результат взаимодействия первых двух. Как сочетать эти данные с предыдущими надежными результатами, показывающими ведущую роль серого серпа, пока неясно. Сейчас появились работы, где пересматриваются эти, казалось бы классические, представления о роли серого серпа.

Мы видим, что понятия мозаичного и регуляционного развития должны быть близко связаны с ооплазматической сегрегацией. У мозаичных яиц она обычно более выражена, т. е. яйцо содержит больше различных зон (6–8). Ho главное в том, что различия между участками цитоплазмы яйца у них, очевидно, более глубоки, так как необратимо предопределяют судьбу клеток, которые эту цитоплазму получают. В яйцах регуляционного типа и зон меньше (2–3), и судьба клеток лишь отчасти зависит от состава цитоплазмы. В не меньшей степени она зависит от взаимоотношений между клетками. Благодаря этим взаимным влияниям зародыш, лишенный части клеток, способен нормально развиваться. Яйца же мозаичного типа образуют группу правильно расположенных, но относительно независимых клеток. Если часть их удалить, другие клетки уже не могут изменить свой путь развития и заменить отсутствующие. Таким образом, ооплазматическая сегрегация является важным и первым фактором дифференциации. Вероятно, только при развитии зародышей млекопитающих она не играет заметной роли.

Механизмы создания ооплазматической сегрегации известны плохо. Важнейшие события самой сегрегации или подготовки к ней происходят в оогенезе. Так, в оогенезе амфибий возникают различия вдоль анимально‑вегетативной оси, да и сами анимальный и вегетативный полюсы яйца определяются уже в ооците. Предполагают, что полюсы и неравномерное отложение желтка создаются благодаря ориентировке ооцита по отношению к кровеносным сосудам, из которых в яйцо поступает предшественник желтка – вителлогенин.

Место образования серого серпа во многом, если не целиком определяется внешними к яйцу факторами, уже после оплодотворения. Одним из них может служить место вхождения сперматозоида – серый серп образуется с противоположной стороны. Однако этот фактор не единственный, а у большинства видов он, по‑видимому, совсем не играет роли.

Если яйцо амфибий (или осетровых рыб) в первое время после оплодотворения наклонить набок и дать ему снова подняться анимальным полюсом вверх, то серый серп образуется в плоскости поворота на той стороне, которая была внизу. Эту манипуляцию можно повторить несколько раз: серый серп образуется в плоскости последнего поворота. Ho через 30–40 мин положение серого серпа детерминируется и изменить его уже нельзя.

Механизм ооплазматической сегрегации у других видов животных практически не изучен. Можно, по‑видимому, утверждать, что в оогенезе, например, асцидий образуются различные вещества и структуры, которые до оплодотворения распределены в яйце более или менее равномерно. Ho после оплодотворения эти вещества каким‑то образом концентрируются и локализуются в виде полярных плазм, «серпов» и других образований, которые затем закономерно перемещаются по яйцу.

Важную роль в ооплазматической сегрегации, по‑видимому, играет поверхность яйца, служащая своеобразным каркасом. Это иллюстрируется опытами, в которых яйца амфибий центрифугировали так, что вся организация яйца нарушалась. Однако после этого происходило постепенное восстановление нормальной организации яйца, включая ту, что была достигнута в результате ооплазматической сегрегации.

Ооплазматическая сегрегация костистых рыб изучалась в нашей лаборатории. У вьюна только что отложенное яйцо шарообразно. Однако в течение первого получаса на его поверхности выделяется тонкий прозрачный свободный от желтка слой, который стягивается к анимальному полюсу и в итоге образует на нем бластодиск – цитоплазматический бугорок, который у вьюна занимает 1/5–1/10 часть объема всего яйца (у разных видов рыб бластодерма составляет от 1/3 до 1/20 всего объема). В бластодиске находится ядро, и только бластодиск делится во время дробления яйца, образуя на анимальной стороне «шапочку» клеток – бластодерму. Оказалось, что в бластодерме сконцентрированы многие (хотя и не все) ферменты яйца – их в ней от 50 до 80 %, т. е. концентрация ферментов в бластодерме в 10–25 раз выше, чем в остальной части яйца, заполненной желтком. Каков механизм такой концентрации? Исследуя это явление разными методами, мы обнаружили, что в бластодерме происходит связывание ферментных молекул со структурами клетки.

Очевидно, ооплазматическая сегрегация у рыб происходит в два этапа. Сначала на поверхности яйца образуется цитоплазматический бугорок – бластодиск. Механизм этого процесса остается неизвестным, но в нем, по‑видимому, участвуют структурные белки клеточного скелета, каким‑то образом отделяющиеся от массы желтка. Затем уже эти структурные белки связывают ферменты и как бы насасывают их в бластодерму. Этим создается неравномерность распределения ферментов по яйцу, в результате чего запасенные в оогенезе ферментные белки оказываются собранными в клетках зародыша, где они и должны функционировать.

Нам осталось рассмотреть вопрос о том, каким образом ооплазматическая сегрегация создает различия между клетками, т. е. почему некоторые (может быть, небольшие) различия в составе цитоплазмы приводят к разным направлениям дифференцировки. Сами исходные различия в цитоплазме между бластомерами, очевидно, не следует называть дифференцировкой: до определенного времени эти различия никак не сказываются на форме и поведении клеток. Ho затем, часто с началом гаструляции, различия в метаболизме и поведении клеток становятся очевидными. Можно предполагать, что даже небольшие различия цитоплазмы приводят к активации разных наборов генов. Однако каковы те конкретные химические вещества, которые создают различия зон цитоплазмы яйца, и каким образом эти вещества определяют включение разных генов, неизвестно.

Индукция

В «классической» механике развития эмбриональной индукцией называют такое влияние одной ткани на другую, соседнюю, которое вызывает в месте контакта новую дифференцировку. Иногда (обычно в искусственной экспериментальной ситуации) индуцирующая ткань (индуктор) уподобляет индуцируемую ткань себе (гомотипичная индукция). Ho в нормальном развитии индуктор вызывает в индуцируемой части второй ткани новую, третью дифференцировку. Таким образом, эмбриональная индукция приводит к увеличению числа клеточных типов и этим усиливает дифференциацию зародыша.

Главной моделью и объектом большинства исследований была и есть так называемая первичная эмбриональная индукция у амфибий, когда в ходе гаструляции или тотчас после нее зачаток хордомезодермы вдоль спинной стороны зародыша индуцирует в эктодерме над собой зачаток нервной системы – нервную пластинку, которая свертывается в нервную трубку и дифференцируется в головной и спинной мозг. Остальная эктодерма почти целиком становится эпителием кожи, и только на границе эктодермы и нервной пластинки узкая полоска ткани (нервный гребень) превращается в мигрирующие клетки, которые участвуют в образовании хряща и пигментных клеток кожи. Если зачаток хордомезодермы еще в самом начале гаструляции удалить, нервной системы не образуется, если же этот зачаток пересадить под раннюю эктодерму на боку или животе другого зародыша, то там образуется вторая нервная система.

Первичная эмбриональная индукция является региональной. Это означает, что передняя часть зачатка хордомезодермы индуцирует в эктодерме передние отделы мозга, следующая за ней – средний и задние отделы головного мозга, а задняя половина хордомезодермы индуцирует спинной мозг. Позже, когда уже образуется хорда, а нервная пластинка замыкается в трубку и погружается под эктодерму, она сама становится индуктором и индуцирует в окружающих ее свободноподвижных мезенхимных клетках дифференцировку в хрящ позвонков.

Второй классической моделью индукции, традиционно изучаемой в нашей стране, является развитие глаз. У нас есть эмбриологи, успешно работающие над этой проблемой более 40 лет. Зачатки глаз (глазные пузыри) вначале являются парными выростами переднего мозга. Глазной пузырь подходит к эктодерме, касается ее, а затем его передняя поверхность начинает вворачиваться внутрь наподобие того, как можно вдавить плохо надутый мяч. Так из глазного пузыря возникает глазной бокал. Внутренняя стенка бокала станет очень сложно устроенной сетчаткой, а наружняя – очень просто организованным пигментным эпителием. Когда глазной пузырь касается эктодермы, он индуцирует в ней образование хрусталика (линзы). Клетки эктодермы впячиваются в полость глазного бокала и образуют эпителиальный однослойный пузырек, который отделяется от эктодермы. Далее клетки задней стенки этого пузырька вытягиваются и заполняют всю его полость. Это и есть готовый хрусталик.

Если глазной пузырь удалить до того, как он коснется эктодермы, линзы обычно не образуется; если же глазной пузырь пересадить под эктодерму в любом месте зародыша (но в довольно узкий период развития), то линза образуется там. В следующий период развития, когда глазной бокал и линза в нем уже образованы, они еще раз становятся индукторами и снова действуют на эктодерму. На этот раз они вызывают в ней просветление – образование прозрачной роговицы глаза.

Явление эмбриональной индукции было открыто в первые десятилетия нашего века и связано с именем Ганса Шпемана. Ho относительно недавно был показан еще один случай индукции, действующей на самых ранних стадиях, еще до индукции нервной системы. Голландский ученый Ньюкоп удалял у тритона экваториальную часть бластулы, т. е. будущую мезодерму. В этом случае мезодерма у таких зародышей все же возникала – она индуцировалась в эктодерме, очевидно, под влиянием энтодермы. Из этих опытов следует, что ооплазматическая сегрегация определяет только два зачатка, а третий возникает между ними как результат индукции. Однако многочисленные данные о роли серого серпа и другие факты не позволяют так легко отказаться от ужо имеющихся представлений.

Представления о механизме индукции имеют длинную и сложную историю, в которой пока нет ясного конца. Проще всего представить, что индуктор выделяет, а индуцируемая ткань получает некое индуцирующее вещество. Это вещество не обязательно должно быть очень сложным и специфичным, важно, чтобы на данной стадии развития оно попадало в индуцируемую ткань только в необходимом месте и тем самым определяло место новой дифференцировки.

Низкая специфичность индуктора очевидна из ряда опытов. Если под эктодерму одного вида животных пересаживать индуктор от другого вида, то характер индуцируемой нервной трубки всегда идет не в соответствии с видом индуктора, а в соответствии с видовыми особенностями индуцируемой эктодермы. Индукцию можно получить при действии очень различных чужеродных источников индукции. Например, из зародыша цыпленка, причем на поздней стадии, удалось выделить индуцирующие вещества, действующие на амфибий. Все это показывает, что специфическую роль играет компетенция индуцируемых клеток – она существует только у определенной ткани и обычно только в течение короткого периода раз‑ вития. Тем не менее те индуцирующие вещества, которые удалось очистить, оказались белками, т. е. достаточно сложными веществами.

Из недавних опытов немецкого ученого Тидемана следует, однако, что чистый индуктор, который вызывает индукцию нервной системы (нейральный индуктор), не проникает в клетки эктодермы, а, очевидно, остается на поверхности клеток (ниже мы увидим, что так же действуют все белковые гормоны). Следовательно, вряд ли имеет смысл говорить, что индукторы могут дать клетке программу дифференцировки, скорее они лишь осуществляют выбор среди тех немногих программ, которые уже имеются в компетентных клетках.

Впрочем, вопрос этот в большой степени терминологический: что значит определить саму программу или осуществить выбор среди программ? Зависит ли от индуктора, быть или не быть данной дифференцировке? Конечно, зависит. Содержит ли вещество индуктора, пусть самое сложное, информацию о том, какой должна быть дифференцировка, какова будет форма клеток или органа и т. д.? Конечно, нет. В таком случае, кажется, удобнее говорить о выборе программ, а не о самой программе. Иначе термин «программа» теряет всякий смысл.

В истории изучения индукции большое место занял период, когда индукцию вызывали, действуя самыми различными факторами, включая убитые ткани и солевые растворы. Финский исследователь Тойвонен показал, что региональность индуцирующего действия хордомезодермы у лягушки можно хорошо имитировать, действуя в разных соотношениях экстрактами убитых кипячением кусочков печени и костного мозга морской свинки. Даже чистые индукторы, полученные Тидеманом, никак нельзя считать естественными: ведь в тканях большого зародыша цыпленка не может случайно оказаться тот же самый белок, который вызывает индукцию нервной системы в нормальном развитии раннего зародыша амфибий.

Очевидно, подобные вполне чистые вещества можно выделить из очень разных источников, в том числе и из амфибий, но это лишь свидетельствует об их низкой специфичности. Получить же в чистом виде естественный индуктор, т. е. то самое вещество, которое поступает из хордомезодермы в эктодерму, пока еще не удалось никому.

Иногда предполагают, что сами индуцируемые клетки содержат много разных индукторов, но в неактивном виде.

Далее одни клетки выделяют эти индукторы наружу, а другие, напротив, концентрируют их в себе или активируют внутри себя. Подобные построения позволяют создать много различных схем. Проверить их пока одинаково трудно, поэтому ценность таких схем невелика.

Об индукции можно говорить еще очень много, но это скорее следствие не обилия, а, напротив, недостатка знаний. Мы знаем много фактов на клеточном уровне, но мало – на молекулярном. В результате мы не имеем пока хорошей теории, в которую бы укладывались все известные факты. Подводя итоги, можно сказать, что индукции играют важнейшую роль в эмбриональных дифференцировках и некоторую роль в дифференцировках во взрослом организме. Однако ими можно объяснить далеко не все случаи дифференцировки, часто действуют другие, пока еще неизвестные механизмы.

Индукция, по определению, может произойти при близком контакте индуцирующей и индуцируемой тканей, во всех случаях она, по‑видимому, происходит путем миграции определенных веществ. Однако в одних случаях эти вещества могут, преодолевая некоторое расстояние, мигрировать из клеток индуктора в клетки индуцируемой ткани, а в других – необходим прямой контакт между этими клетками. Вероятно, это свидетельствует о различной природе индуцирующих факторов. Хотя естественный индуктор ни в одном случае не выделен, похоже, что это белки небольшого молекулярного веса.

Однако то, что пока не смогли сделать на высокоорганизованных амфибиях, удалось на представителях низших многоклеточных животных – кишечнополостных актиниях и гидре. У них в самое недавнее время группой американских ученых был обнаружен и выделен в чистом виде индуктор, определяющий формирование головного конца животного. Индуцирующим веществом оказался олигопептид – цепочка, состоящая из одиннадцати определенных аминокислот. У морских актиний и пресноводной гидры (два разных класса) последовательность аминокислот оказалась тождественной, т. е. за много миллионов лет раздельной эволюции этих групп животных индуцирующее вещество не изменилось. Механизм индукции неясен, но трудно сомневаться в том, что в конечном итоге он состоит в активации определенных генов, запускающих всю программу дифференцировки. Роль индукции в развитии состоит в определении места дифференцировки, т. е. индуцирующее вещество – это источник позиционной информации, по которому индуцируемая клетка «узнает», где она оказалась и кем ей «следует стать». Поэтому индукцию следует считать важным (но не единственным) инструментом пространственной организации зародыша и его развития.