IV. Тонкослойная хроматография (ТСХ) как метод установления подлинности ЛРС

Хроматографический метод – один из важных и распространенных методов фитохимического анализа. Он эффективен и удобен для разделения многокомпонентных смесей, очистки и идентификации соединений. По механизму разделения различают три основных вида хроматографии: адсорбционную, распределительную и ионообменную. В основе их лежат неодинаковая степень адсорбируемости молекул (ионов) на твердом веществе (адсорбционная и ионообменная хроматография) или различное распределение их между двумя несмешивающимися жидкими фазами, одна из которых связана с твердым носителем (распределительная хроматография). В зависимости от целей и задач анализа применяют различные сорбенты и виды хроматографии: колоночную, бумажную и тонкослойную. Бумажная и тонкослойная хроматография позволяет работать с микроколичествами органических веществ и не требует дорогостоящего оборудования.

Один из способов установления подлинности ЛРС –тонкослойная хроматография (ТСХ).

Метод тонкослойной хроматографии описан в разделе 2.2.27, ГФ РБ II, т. 1.

Тонкослойная хроматография представляет собой метод разделения, в котором используется неподвижная фаза, состоящая из подходящего материала, нанесенного в виде тонкого слоя и зафиксированного на подложке (пластинке) из стекла, металла или пластмассы. Перед хроматографированием растворы анализируемых веществ наносят на пластинку. Разделение основано на процессах адсорбции, распределения, ионного обмена или на их комбинации и осуществляется посредством перемещения в тонком слое (неподвижной фазе) исследуемых веществ, растворенных в растворителе или соответствующей смеси растворителей (ПФ).

Хроматографирование проводят с использованием пластинок, полученных, как указано в разделе «Реактивы» (ГФ РБ II, т. 1). Современная хроматографическая пластинка представляет собой основу из стекла, алюминия или полимера (например, политерефталат). В связи с тем, что стеклянная основа становится менее популярной (часто бьется, нельзя разделить пластинку на несколько частей, не повредив слой сорбента, тяжелая по весу), наибольшее распространение получили пластинки, в качестве основ которых используют алюминиевую фольгу или полимеры. Для закрепления сорбента применяют гипс, крахмал, силиказоль и др., которые удерживают зерна сорбента на подложке. Толщина слоя может быть различна (100 и более мкм), но самый важный критерий - слой должен быть равномерный по толщине в любом месте хроматографической пластинки.

В ТСХ могут использоваться пластинки заводского производства и изготовленные собственноручно. Последние могут иметь закрепленный (при помощи подходящего фиксатора – гипса, крахмала) либо незакрепленный слой сорбента (для насыпной ТСХ, отличающейся быстротой выполнения – 10-20 минут, чувствительностью и точностью).

Пластинки с закрепленным слоем сорбента изготавливают следующим образом. Подбирают пластинки нужного размера, моют их и сушат. Готовят сорбционную массу: смешивают сорбент, содержащий 5% гипса, с дистиллированной водой в отношении 1:2; для этого сорбент растирают сначала с 70% необходимой воды в фарфоровой ступке до получения однородной пасты, не содержащей пузырьков воздуха, затем добавляют к пасте при размешивании остальные 30% воды. На всю работу уходит 1-2 минуты. Сорбционную массу можно также получить при энергичном взбалтывании той же массы в колбе с притертой пробкой. Для обнаружения пятен нефлуоресцирующих веществ, способных поглощать ультрафиолетовые лучи, при приготовлении сорбционной массы к сорбенту вместо воды добавляют водные растворы флуоресцирующих веществ, смешанные сульфиды цинка и кадмия, цинка силикат и др. Приготовленную сорбционную массу наносят на пластинки и равномерно распределяют ее с помощью специального прибора или металлического валика. Затем пластинки сушат при комнатной температуре 15-20 минут. В качестве фиксаторов служат: гипс медицинский или штукатурный, крахмал рисовый и маисовый. Пластинки хранят в эксикаторе или специальном шкафу под силикагелем или кальция хлоридом.

В качестве сорбентов могут использоваться следующие вещества.

Силикагель - гидратированная кремниевая кислота, образующаяся при действии минеральных кислот на силикат натрия и сушкой образовавшегося золя. После размалывания золя используют фракцию определенной зернистости (указанную на пластинке, обычно 5-20 мкм). Силикагель является полярным сорбентом, у которого в качестве активных центров служат группы -ОН. Он легко сорбирует на поверхности воду и образует водородные связи.

Алюминия оксид - является амфотерным адсорбентом и используется, в основном, для разделения соединений слабоосновного и нейтрального характера. Недостатком пластин на основе алюминия оксида является обязательная активация поверхности в сушильном шкафу при высокой температуре (100-150˚С) перед использованием и низкая, по сравнению с силикагелем, адсорбционная емкость слоя. Различают пять степеней активности алюминия оксида по Брокману:

I степень – 0% воды

II степень – 3% воды

III степень – 6% воды

IV степень – 10% воды

V степень – 15% воды.

Алюминия оксид часто используется в качестве сорбента для насыпной ТСХ. Сорбент помещают на небольшие стекла из оконного стекла; можно использовать и предметные стекла.

Кизельгур - адсорбент, полученный из природных минералов - диатомовых земель. Сорбент обладает гидрофильными свойствами, но более низкой адсорбционной емкостью слоя по сравнению с силикагелем.

Кремнекислый магний - менее полярный, чем силикагель, и обычно используется в случаях, когда более полярные адсорбенты не дали эффективного разделения.

Целлюлоза - тонкослойные пластины с нанесенной целлюлозой очень эффективны для разделения сложных органических молекул. Адсорбент представляет собой, в основном, шарики целлюлозы диаметром до 50 мкм, закрепленные на носителе крахмалом. Но подъем фронта растворителя при использовании таких пластин происходит очень медленно.

В ионообменных хроматографических пластинках в качестве адсорбента используют ионообменные смолы, содержащие четвертичный аммоний или активные сульфогруппы, участвующие в ионном обмене. Тонкослойная хроматография с такого типа пластинками проводится с ПФ, содержащими сильные кислоты или щелочи. Данные пластинки эффективны для разделения высокомолекулярных и амфотерных соединений.

Вышеперечисленные сорбенты являются наиболее распространенными, однако в качестве сорбентов могут быть использованы также тальк, кальция сульфат, крахмал и т.д. Кроме того, вышеперечисленные сорбенты могут быть модифицированы для придания им новых сорбционных свойств (пропитка сорбентов реактивами, например, раствором серебра нитрата, создание пластин с обращенной фазой). Такое разнообразие сорбентов позволяет использовать метод ТСХ для идентификации ЛРС, содержащего самые разные БАВ.

Сорбенты и готовые пластинки должны отвечать требованиям раздела «Реактивы» ГФ РБ II, т. 1. Например, силикагель G (содержит около 13% кальция сульфата полугидрата) должен выдерживать требования по показателям «Кальция сульфат» (количественное определение методом комплексонометрии) и «рН»; силикагель GF (содержит около 13% кальция сульфата полугидрата и около 1,5% флуоресцентного индикатора, имеющего оптимальную интенсивность поглощения при длине волны 254 нм) должен выдерживать требования по показателям «Кальция сульфат», «рН», «Флуоресценция». Рекомендуется каждую партию получаемых пластинок, приготовленных в промышленных условиях, проверять на близость величин R_f.

Фактор (величина) удерживания, R_f (от англ. «retention factor») определяют как отношение расстояния от точки нанесения пробы до центра пятна после хроматографирования к расстоянию, пройденному фронтом растворителя от точки нанесения пробы. В соответствии с определением, R_f всегда меньше единицы. Величина R_f зависит от техники эксперимента, активности и природы сорбента, толщины слоя сорбента, температуры, качества и природы растворителя.

При проверке партии пластинок проводят испытания не менее чем на трех единицах, используя методику проверки хроматографической разделяющей способности, приведенной в разделе «Реактивы», ГФ РБ II, т. 1 («ТСХ пластинка со слоем силикагеля»). На линию старта каждой пластинки наносят по 5 пятен раствора для проверки пригодности ТСХ пластинок, хроматографируют и рассчитывают величины R_f красителей для каждого нанесения. В пределах каждой пластинки наибольшая разница величин R_f среди разных нанесений для каждого красителя не должна превышать 0,02. В противном случае такие пластинки не рекомендуется использовать для фармакопейного анализа.

В некоторых случаях может понадобиться предварительная подготовка пластинок перед хроматографированием. Это связано с тем, что сорбенты пластин при хранении поглощают влагу и другие вещества, содержащиеся в воздухе. При использовании неподготовленных пластинок в процессе хроматографирования появляется фронт «грязи», который может помешать определению веществ, имеющих большие значения R_f, а некоторые вещества, например вода, могут изменять состав подвижной фазы, влияя тем самым на получаемые результаты. Предварительная подготовка пластин заключается в промывке пластинок чистым растворителем на всю их высоту (метанол, бензол, диэтиловый эфир) с последующей сушкой в сушильном шкафу. Таким способом можно подготовить сразу несколько пластинок и хранить их в герметичном контейнере. Пластинки могут быть подготовлены также погружением в растворитель или опрыскиванием. Перед использованием пластинки активируют, если необходимо, посредством нагревания в термостате при температуре от 100˚С до 105˚С в течение 1 часа.

Допускаются другие условия активации пластинок, описанные в частных статьях.

Хроматографическая камера представляет собой емкость с плотно подогнанной крышкой и с плоским дном или дном с двумя желобами из инертного прозрачного материала, соответствующими по размеру используемым пластинкам.

Способ горизонтального элюирования наиболее сложен в отношении оборудования. Используются специальные хроматографические камеры, представляющие собой невысокую плоскую емкость с желобом для ПФ и устройством для подачи ПФ к неподвижной фазе. В такой камере пластинка размещается горизонтально, и подача ПФ происходит на один край пластинки с помощью фитиля. Фронт ПФ движется в противоположную сторону. Иногда хроматографическую пластинку на алюминиевой основе при помещении в такую камеру слегка изгибают в продольном направлении и помещают в камеру. В таком случае система поступает с двух сторон одновременно. Для этой цели подходят только пластины с алюминиевой подложкой, так как она сохраняет придаваемую форму (в отличие от стеклянной). Одно из достоинств камер для горизонтального элюирования - быстрое насыщение парами ПФ вследствие малых размеров, постоянная скорость движения фронта ПФ.

В необходимых условиях допускается использование хроматографических камер других типов с описанием их в частных статьях.

Для нанесения хроматографируемых растворов используют микропипетки, микрошприцы, калиброванные капилляры или другие устройства.

Проявляющие реактивы – реактивы для обнаружения разделенных веществ. Хроматограммы проявляют посредством опрыскивания, обработки парами или погружения в соответствующие проявляющие реактивы.

Хроматографирование может осуществляться несколькими способами, отличающимися, в основном, направлением движения подвижной фазы:

• вертикальное элюирование;
• горизонтальное элюирование;
• нисходящее элюирование (не описано в ГФ РБ));
• радиальное элюирование (не описано в ГФ РБ);

Если нет других указаний в частной статье, хроматографическое разделение выполняют восходящим способом в насыщенной атмосфере. Предпочтительнее использовать такие ПФ, которые обеспечивают величины R_f испытуемых соединений в пределах от 0,3 до 0,7.

Вертикальное элюирование. Стенки хроматографической камеры выстилают фильтровальной бумагой. ПФ наливают в камеру в количестве, достаточном для того, чтобы после смачивания фильтровальной бумаги покрыть дно камеры слоем жидкости, необходимым для хроматографирования. Для насыщения хроматографическую камеру с ПФ закрывают крышкой и выдерживают в течение 1 часа при температуре от 20˚С до 25˚С. Слой жидкости в хроматографической камере должен быть таким, чтобы после помещения в него пластинки пятна или полосы находились над уровнем жидкости.

Объемы растворов анализируемых веществ, указанные в частной статье, наносят небольшими порциями, получая полосы или круглые пятна на подходящем расстоянии от нижнего края и от боковых краев пластинки. Растворы наносят на линию, параллельную нижнему краю пластинки, на расстоянии не менее 10 мм между пробами. Если нет других указаний в частной статье, пятна или полосы наносят на расстоянии не менее 15 мм от нижнего края и не менее 10 мм от боковых краев пластинки.

После испарения растворителей из нанесенных проб пластинку помещают в хроматографическую камеру как можно более вертикально, следя за тем, чтобы пятна или полосы находились выше поверхности подвижной фазы. Камеру закрывают, оставляют ее при температуре от 20˚С до 25˚С в защищенном от прямых солнечных лучей месте. После того как подвижная фаза пройдет расстояние, указанное в частной статье, пластинку вынимают, сушат и обнаруживают пятна способом, указанным в частной статье.

В случае двухмерной хроматографии после первого хроматографирования пластинку сушат и выполняют второе хроматографирование в направлении, перпендикулярном первому.

Горизонтальное элюирование. Объемы растворов анализируемых веществ, указанные в частной статье, наносят небольшими порциями, получая круглые пятна (от 1 мм до 2 мм в диаметре) или полосы (длиной от 5 мм до 10 мм и шириной от 1 мм до 2 мм) на подходящем расстоянии от нижнего края и от боковых краев пластинки (если нет других указаний в частной статье, пятна или полосы наносят на расстоянии не менее 15 мм от нижнего края и не менее 10 мм от боковых краев пластинки). Растворы наносят на линию, параллельную нижнему краю пластинки, с интервалом не менее 5 мм между нанесенными пробами.

После испарения растворителей из нанесенных проб в желоб хроматографической камеры вводят с помощью шприца или пипетки достаточное количество ПФ, помещают пластинку горизонтально в хроматографическую камеру и подсоединяют устройство для подачи ПФ в соответствии с инструкцией производителя. Если указано в частной статье, пластинку элюируют, начиная одновременно с двух концов. Камеру закрывают и проводят хроматографирование при температуре от 20˚С до 25˚С. После того как ПФ пройдет расстояние, указанное в частной статье (НД), пластинку вынимают, сушат в соответствующих условиях и обнаруживают пятна указанным способом.

Нисходящее элюирование. Эта методика хроматографирования имеет ту особенность, что ПФ опускается по пластинке под действием сил тяжести, т.е. сверху вниз. Для этого в верхней части хроматографической камеры крепится кювета с системой растворителей, из которой с помощью фитиля на хроматографическую пластинку поступает ПФ. К недостаткам этого метода можно отнести усложнение оборудования.

Радиальное элюирование. При этом способе хроматографирования испытуемый раствор наносится в центр пластинки, туда же подается ПФ, которая движется от центра к краю пластинки.

Метод ТСХ используется, в основном, для установления подлинности (идентификации) исследуемых объектов (образцов).

Идентификация. Основное пятно на хроматограмме, полученной для испытуемого раствора, сравнивают визуально с соответствующим пятном на хроматограмме, полученной для раствора стандартного образца (раствора сравнения), сравнивая окраску (цвет флуоресценции), размер и величину фактора удерживания (R_f) обоих пятен.

Для проверки разделяющей способности неподвижной фазы достаточно испытания на пригодность неподвижной фазы (пластинки), описанного в разделе «Реактивы». В особых случаях дополнительные требования указывают в частных статьях.

В том случае, когда вещества, разделяемые методом тонкослойной хроматографии, поглощают или флуоресцируют в ультрафиолетовом или видимом свете, их можно количественно определить непосредственно на пластинке, используя подходящее оборудование. Для этого измеряют отражение или пропускание падающего света, передвигая пластинку или измеряющее устройство.

Аналогичным образом, используя подходящее оптическое оборудование, можно измерять флуоресценцию.

Вещества, содержащие радионуклиды, могут быть количественно определены тремя способами:

- непосредственно на пластинке – передвижением пластинки вдоль подходящего счетчика радиоактивности или счетчика радиоактивности вдоль пластины;

- разрезанием пластинки на полосы и измерением радиоактивности на каждой полосе, используя подходящий счетчик радиоактивности;

- соскребанием неподвижной фазы, растворением ее в подходящем сцинтилляционном коктейле и измерением радиоактивности с использованием жидкостного сцинтилляционного счетчика.