Счет радиоактивности в элюатах белка

Все перечисленные в предыдущем разделе способы элюции
белков из геля позволяют оценивать их радиоактивность с по-
мощью приемов счета радиоактивности в растворах. Следует
помнить, что элюция белка из геля никогда не бывает полной,
поэтому количественная оценка содержания белка в полосе геля
при таком подходе носит более или менее приближенный харак-
тер. Кроме того, элюция связана со значительным разбавлением
белкового раствора.

Один из специфических вариантов счета радиоактивности
элюата из геля после электрофореза белков в комплексе с
ДДС-Na отработан именно для концентрирования белкового
препарата. В нем используется способность комплекса белок—
ДДС-Na при пониженной температуре и обработке 10%-ным рас-
твором ТХУ образовывать мицеллы, которые сорбируются на
нитроцеллюлозных фильтрах типа «Millipore НА». К элюату бел-
ка в 1%-ном растворе ДДС-Na с 6 М мочевиной добавляют в
качестве носителя бычий сывороточный альбумин до концентра-
ции 0,25 мкг/мл, а затем 2 объема 15%-ного раствора ТХУ.
Смесь хорошо встряхивают и оставляют на 15 мин во льду. Пос-
ле этого ее можно фильтровать и промывать на фильтре 5%-ным
раствором ТХУ. Счет радиоактивности ведут на фильтрах. Ис-
пользование фильтра типа «Millipore» здесь обязательно, так как
в присутствии ДДС-Na ТХУ не дает обычного осадка белка, а
на бумажных или стекловолокнистых фильтрах мицеллы комп-
лексов белок—ДДС-Na не задерживаются [Buisson et al., 1976].

Для качественного определения радиоактивности ¹⁴С и ¹²⁵I
белковые полосы и пятна (при толщине геля не более 1,5 мм)
можно вырезать и просто высушить на поверхности любого из
стекловолокнистых фильтров типа «Whatman GF» или даже на
бумажном фильтре «Whatman N 1». Сушить достаточно 30 мин
при 50° или 2 ч при комнатной температуре. Счет радиоактивно-
сти ведут в толуоловом сцинтилляторе [Leinen, Wittliff, 1978].

Другой вариант с использованием фильтров типа GF/C вклю-
чает диффузию нефиксированных комплексов белок—ДДС-Na
из кусочков геля толщиной 0,7 мм в фильтры, смоченные
10%-ным раствором NH₄OH. Диффузия идет в течение суток при
комнатной температуре в атмосфере аммиака. Затем фильтры
.сушат и просчитывают в толуоловом сцинтилляторе. Как и всег-
да при диффузии, полнота выхода белков зависит от их молеку-
лярной массы и пористости геля [Helliner, Wunner, 1971].