Флюорография

Для регистрации положения в геле белков, меченных три-
тием, применяют метод флюорографии. Смысл его в том, чтобы
ввести сцинтиллятор внутрь геля таким образом, чтобы он нахо-
дился в непосредственном контакте с радиоактивными белками
в полосах. Свечение сцинтиллятора внутри геля легко выходит

из него наружу и регистрируется наложенной на гель рентгенов-
ской пленкой того же типа, который используют при непрямой
авторадиографии. По существу говоря, такой подход уже был
рассмотрен выше, но тогда не стояла задача сохранения геомет-
рических размеров целой пластины геля, чего трудно добиться
при импрегнировании в гель жидкого сцинтиллятора.

Повсеместное распространение для флюорографии гелей по-
лучила процедура, предложенная в 1974 г. Боннером и Ласки.
Сначала воду в геле замещают на диметилсульфоксид (ДМСО),
вымачивая пластину после фиксации в ней белков в течение 1 ч
в двух сменах по 20 объемов ДМСО (по отношению к объему
геля). Надо помнить, что ДМСО ядовит и легко проникает через
кожу, поэтому работать следует в перчатках. Затем гель перено-
сят на 3 ч в 4 объема 22%-ного (масса/объем) раствора ППО в
ДМСО; за это время ППО входит в гель. ДМСО не является
сцинтилляционным растворителем, поэтому его необходимо
убрать, но так, чтобы ППО остался в геле. Высушить ДМСО не
удается, и приходится прибегать к следующему приему. Гель
переносят в воду и вымачивают в ней около 1 ч. ППО в воде не-
растворим и немедленно выпадает в осадок. Гель становится
белым, непрозрачным и заметно твердеет, зато ДМСО снова за-
мещается на воду, которую затем нетрудно высушить, как было
описано выше. На фильтровальной бумаге после высушивания
остается жесткая белая пленка. Хотя она на вид и непрозрачна,
но вспышки сцинтилляций внутри нее (в местах контакта ППО
с радиоактивными белками) дают достаточно света, чтобы быть
зарегистрированными рентгеновской пленкой. В результате до-
статочно продолжительного экспонирования на пленке появляет-
ся картина расположения радиоактивных полос или пятен в геле
[Bonner, Laskey, 1974]. Засвечивание пленки для повышения ее
чувствительности производят и в этом случае. Экспонирование
пленки следует вести при температуре сухого льда, поскольку
при более высокой, пусть даже и отрицательной температуре
резко снижается чувствительность метода.

Гели с низким содержанием акриламида, например смешан-
ные гели из 2%-ного ПААГ и агарозы, могут растворяться в
ДМСО. Для них в аналогичной процедуре следует заменить
ДМСО на метанол (10%-ный раствор ППО в метаноле). Для
более концентрированных гелей метанол непригоден — гели в
нем сжимаются.

Концентрированные и сильно сшитые гели часто трескаются
при сушке обычным способом. Вакуум к гелю обычно подается
только с одной стороны через сетку и фильтровальную бумагу.
К противоположной стороне геля во время сушки плотно приле-
гает полиэтиленовая пленка или тонкая резина. Это приводит к
тому, что со стороны бумаги гель затвердевает раньше («стек-
ленеет»), а на противоположной его поверхности остается влага,
которая может быть отсосана только через трещинки в геле. Во
избежание этого дефекта было предложено между свободной по-

верхностью геля и пленкой или резиной прокладывать слой по-
ристого полиэтилена, через который вакуум подается и к этой
поверхности геля [Joshi, Haenni, 1980].

Недавно было указано на возможность замены ППО в каче-
стве сцинтиллятора на салицилат натрия [Chamberlain, 1979].
Для него максимум флюоресценции лежит вблизи 410 нм, что
вполне приемлемо для экранированной рентгеновской пленки.
Главное же преимущество этого реагента — в его водораствори-
мости. Автор работы предлагает просто вымачивать гель в
10 объемах 1 М водного раствора салицилата натрия в течение
30 мин при комнатной температуре, а затем сушить и флюоро-
графировать, как обычно. Нагревать гель во время высушивания
следует не выше, чем до 80°, во избежание возгонки салициловой
кислоты. Раствор салицилата можно хранить в течение 1—2 не-
дель. Потом он коричневеет (по-видимому, окисляется).

После флюорографии для количественных определений ра-
диоактивности полосы из высушенного геля можно вырезать,
дать им снова набухнуть в минимальном количестве воды и да-
лее растворять с помощью солюбилизаторов. При оценке эффек-
гивности счета в жидком сцинтилляторе можно пользоваться
только методом внутренней стандартизации.

Для правильного совмещения изображения на рентгеновской
пленке с гелем, без чего из него нельзя вырезать нужные для
счета участки, как и при авторадиографии, пользуются реперны-
ми отметками по углам пластины геля. Эти отметки делают ра-
диоактивными чернилами. С этой целью можно использовать
любые не диффундирующие в геле чернила с примесью плохо
растворимого, достаточно активного меченого препарата. Впро-
чем, забота об отсутствии диффузии чернил относится к случаю
авторадиографии влажных гелей, например при регистрации ра-
диоактивного фосфора. Для высушенных гелей это не так суще-
ственно.

Комбинацией авторадиографии и флюорографии можно ре-
гистрировать в геле двойную метку ³Н и ¹⁴С (например, сопо-
ставлять составы двух белковых смесей). В белки одной смеси
вводят радиоактивную метку по ³Н, в белки второй — по ¹⁴С. Обе
смеси объединяют и разделяют двумерным электрофорезом.
Пластину геля импрегнируют сцинтиллятором, высушивают и
регистрируют флюорографией на пленку «Kodak IR-5» сцинтил-
ляцию от обеих белковых смесей (³H+¹⁴С). С негатива делают
контактный отпечаток, так что все пятна радиоактивности ока-
зываются белыми. Затем с того же геля на неэкранированную
пленку «Kodak NS-5T» при комнатной температуре регистрируют
авторадиографией только ¹⁴С. К свету сцинтилляций эта пленка
нечувствительна. Накладывают вторую пленку на позитив с
первой. Не закрытые черным белые пятна указывают местона-
хождение белков, меченных только тритием, т. е. входящих в
состав только одной из двух смесей. Затем изотопные метки двух
белковых смесей можно поменять местами [McConkey, 1979].

Авторадиографией и флюорографией можно пользоваться не
только для пластин, но и для цилиндрических гелей. Для этой
цели из цилиндрика геля надо в продольном направлении выре-
зать плоский слой толщиной 0,5—1,5 мм. Описано простое приспо-
собление, облегчающее эту операцию [Watts et al., 1977].

Флюорографию нитроцеллюлозных фильтров с перенесенны-
ми на их «репликами» белков из геля осуществляют очень про-
сто. Фильтр погружают в 10%-ный раствор ППО в эфире, высу-
шивают и регистрируют сцинтилляцию на рентгеновскую плен-
ку, как это было описано для высушенного геля. Флюорография
и авторадиография нитроцеллюлозных фильтров осуществляется
лучше, чем в случае гелей, так как белки концентрируются на
поверхности фильтров.