Ферменттер-рестрикталар. Клондау векторлары

Молекулярлы клондауда келесі ферменттермен қолданады:

ДНҚ бөлшектерін алатын ферменттер-рестрикталар;

ДНҚ синтезіне керек ферменттер-полимеразалар;

әр түрлі ДНҚларды қосатын ферменттер-лигазалар.

Фермент рестрикталар ДНҚның бір белгіленген участкелеріне әсер етеді. Сол участкелерді палиндрома деп атайды. Рестрикталарға олар тану сайты болады. Рестрикталар ДНҚға әсер еткенде «жабысқақ» және «бүтін» шеттер жаратылады.

Векторлардың үш тобы болады – плазмидалар, бактериожегілер, космидалар. Векторға келесі талаптар қойылады: жасұшада тұрақты болу үшін репликон болу; реципиенттік жасұшада сұрыпталу үшін селективтік маркері болу керек; тіркелген генді бөліп алу үшін тану сайты болу керек.

Көп векторлар әдейленген жұмыстар атқарады (амплификация векторлары, клондау векторлары, және т.б.)

Клондалған ДНҚ молекулалардың жиынтығын гендердің банкісі немесе геномдардың библиотекасы деп атайды. Гендердің банкісін құрастырғанда ДНҚның керекті тізбегін алдымен клондап кейіннен іріктеп алады. Осы мақсатпен толық ДНҚны рестрикталардың көмегімен бөледі, кейіннен осы бөлшектерді векторға еңгізіп клондау және селекция жұмыстарына жатқызады. Сұрыпталған және бөлініп алынған жасұшаларды зерттеп сақтайды. Сақтау үшін векторлармен қолданады.

Векторлардың қолдану бағыттары түрлеріне байланысты. Плазмидалармен 10 н.п.дейін ДНҚ молекуласын клондағанда қолданады, бактериожегілер 20 н.паралық ДНҚ бөлшектерін сиғызады, космидалар 40 және одан да артық н.паралардың санын алып жүреді.

Плазмида. Плазмида – автономдық репликацияға жарамды экстрахромосомалдық жүзікті екі спиральды ДНҚ молекуласы. Биологиялық негізіне байланысты плазмидалар бактерияларда әр түрлі жұмыстар атқарады (F-плазмидалар жыныс анықтайды, R-плазмидалар антибиотиктерге қарсы тұратын күштерді жігерлетеді).

Репликациялық механизмге байланысты бактериалдық жасұшаларда көп таралған (әр түрлі бактерияларда репликацияланады) және аз таралған (бактериялардың бір түрінде репликацияланады) векторлардың түрлері болады.

Рекомбинанттық молекулаларды генетикалық құрастыру үшін плазмидаларды вектор ретінде келесі ерекшеліктеріне байланысты қолданады:

1) көлемі кішкентай;

2) фермент-рестрикталары тек қана бөтен ДНҚлары бар сайтқа әсер етеді;

3) реципиенттік жасұшаларда сұрыптауға керек бір және одан да көп селекциялық маркерлері болу.

Плазмидалардың маңызды биологиялық ерекшелігі – репликацияны тек қана бактериалдық жасұшаларда өткізу.

Бактерияжегі бас жағынан және ақуызды құйрықтан тұрады.Бас жағында ДНҚ молекуласы орналасқан. Ферменттер ДНҚны үш бөлекке кеседі: L-бөлегі – құрамында бактерияжегінің бас жағын және құйрық жағын қалыптайтын ақуызды молекуланың синтезіне керек генетикалық бағдарлама болады. R-бөлегі – ДНҚ-репликациясына және жасұшаның лизисына керек гендер бар. I/E-бөлегі – колонияны қалыптайтын ген бар.

Жаратылған рекомбинанттық вирус E.coli бактериясының ішінде тасылады.

Космидалар – плазмидалардың және бактерияжегілердің қасиеттері қосылған векторлар. Космидалардың ерекшеліктері: 1) генетикалық бағдарламаның үлкен көлемін алып жүру; 2) библиотека құрастырғанда клондалатын космида жақсы сұрыпталады.