ЛАБОРАТОРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Мокрота. Для исследования у больных собирают утренею порцию мокроты натощак в объеме 3-5 мл в стерильные флаконы с крышкой, который плотно завинчивается. Желательно заранее почистить зубы и прополоскать рот кипяченой водой или раствором натрия гидрокарбоната ( 1 чайная ложка на стакан воды). Если пациент плохо выделяет мокроту, или откашливает ее эпизодически и в скудном объеме, то накануне вечером и рано утром в день сбора мокроты ему следует дать отхаркивающее средство. При подозрении на туберкулез, пневмоцистную и легионелёзную пневмонию необходимо применять раздражающие аэрозольные ингаляции путем вдыхания в течение 10-15 мин 30-60 мл подогретого до 42-45 °С раствора, приготовленного на стерильной воде, содержащей 150 г/л хлорида натрия и 10 г/л натрия бикарбоната. Получаемая индуцированная мокрота идентична качеству отхаркиваемой мокроте.

Для диагностики острой бактериальной инфекции достаточно одного образца мокроты, при исследовании на туберкулез или грибковую инфекцию собирают утреннюю мокроту 3 дня подряд, при этом не желательно накапливать ее объем более 12 часов из-за чрезмерной контаминации посторонней бактериальной флорой. Сроки доставки мокроты в лабораторию не должны превышать 1,5-2 ч с момента ее получения ( допускается хранение в холодильнике, но не более 6 ч), поскольку задержка ведет к аутолизуStreptococcuspneumoniae, за счет размножения бактерий - контаминантов меняется действительное соотношение микрофлоры бронхиального секрета.

Перед посевом мокроту промывают в стерильном физиологическом растворе, готовят мазок для микроскопии, разжижают муколитиками или гомогенизируют в асептических условиях в ступке со стерильным песком, проводят десятикратные серийные разведения в бульоне, из которых делают дозированный посев на питательные среды с последующей количественной оценкой каждого типа колоний микроорганизмов, которые выросли.

Образцы, которые отправляются в референсную лабораторию для посева на микобактерии туберкулеза перевозят в охлажденном состоянии или их необходимо сначала обработать натрия хлоридом во флаконах или пробирках сплотно завинчивающимися крышками,которыезатем помещают в металлический сосуд со стенками из адсорбирующего материала и упаковываются в назначенной для транспортировки контейнер. Образцы для вирусного культивирования должны быть охлажденными, но не замороженными, тогда как для культивирования на хламидии образцы для транспортировки помещают в сахарозо-фосфатную среду и замораживают.

При исследовании на микобактерии туберкулеза для разжижения мокроты перед посевом ее обрабатывают муколитики (например, ацетилцистеином в течение 24-48 часов) и проводят деконтаминацию 2% раствором каустической соды по Ганеману (не более 15 мин) от посторонних бактерий.

После разжижения и деконтаминации образцы центрифугируют (3800 оборотов в минуту), осадокмикроскопируют и проводят посев. Перед посевом на легионеллы следует использовать муколитики для разжижения мокроты.

При микроскопии мокроты определяется:

• клеточное состояние мокроты (инфекция > 25 лейкоцитов и < 10 эпителиальных клеток);

• бактерии;

• антигены.

Промывные воды бронхов. Пациенту во время вдоха специальным шприцем в трахею вводят 7-10 мл стерильного изотонического раствора, что вызывает кашлевой рефлекс. При этом больной откашливает секрет из глубоких отделов бронхиального дерева, его собирают в стерильный флакон и немедленно отправляют в лабораторию. БС, в частности вблизи очага воспаления, может быть произведена с помощью бронхоскопа. Пациентам с выраженным глоточным рефлексом указанную процедуру производят после предварительной анестезии надгортанника, гортани и задней стенки глотки. Недостаток - значительное разведение трахеобронхиального содержимого снижает возможность выделения бактерий, а концентрация их падает примерно в 100 раз по сравнению с мокротой.

Транстрахеальный аспират . Аспират из трахеи и дренирующих бронхов, в частности вблизи очага воспаления легочной ткани , получают с помощью бронхоскопа. Следует помнить, что при введении бронхоскопа происходит контаминация секрета нижних отделов дыхательного тракта флорой ротоглотки, это искажает действительные результаты. В отличие от мокроты ТТА можно исследовать на анаэробы.

Бронхоальвеолярный смыв. Бронхоальвеолярный смыв (БАЗ) , при котором проводят промывание сегмента легких стерильным изотоническим раствором, имеет наибольшее значение при постановке диагноза пневмонии, вызванной микобактериями, Pneumocystisjiroveci у пациентов со СПИДом (диагностическая эффективность достигает 89-98%) , также цитомегаловирусом (ЦМВ) у пациентов с иммунодефицитом или после трансплантации органов. Бронхоальвеолярный смыв можно использовать для культуральной диагностики легионеллезной, хламидийной и вирусной инфекции и для изучения с помощью молекулярных методов

Вследствие контаминации материала микрофлорой ротоглотки применениебронхоальвеолярного лаважа (БАЛ) в других клинических ситуациях требует обязательного использования цитологических и количественных критериев его оценки. Наличие менее 1% эпителиальных клеток указывает на отсутствие контаминации орофарингеальной микрофлоры, количественное определение > 10⁴ КОЕ/мл при культуральном исследовании свидетельствует о клинической значимости выделенного микроорганизма. Дополнительно можно готовить окрашенные мазки из осадка после центрифугирования жидкости для выявления бактерий, микобактерий туберкулеза, легионелл и грибов, у больных с иммунодефицитом - пневмоцист. Чувствительность и специфичность метода БАЛ при этиологической диагностике ИНДШ широко варьируют и в среднем составляют, соответственно, 69 ± 22 и 88 ± 14%.

Браш биоптат . Материал получают из бронхов специальной канюлей с защищенными щетками (ЗЩ) с помощью фиброоптическогобронхоскопа. Принцип метода заключается в использовании системы выдвижных каналов, предохраняющие материал от контаминации микрофлорой ротоглотки при вводе и удалении бронхоскопа из нижних отделов дыхательного тракта, это позволяет проводить исследования на анаэробы. Браш-биоптат заливают 1 мл стерильного солевого раствора или натрия лактата раствора сложного (раствора Рингералактата) в асептических условиях и доставляют в лабораторию. Поскольку нельзя полностью исключить контаминацию орофарингеальной микрофлорой , при культуральном исследовании образца используется количественный диагностический критерий > 10³ КОЕ /мл. В различных исследованиях, чувствительность метода ЗЩ варьировала от 22 до 100 %.

Плевральная жидкость. Перед пункцией плевральной полости кожу обрабатывают 70% этиловым спиртом, затем 1-2% раствором йода, который после завершения процедуры удаляют 70 % этиловым спиртом для предотвращения ожога кожи. После прокола плевральную жидкость (ПР) собирают стерильным шприцем и помещают в анаэробную транспортную систему или отправляют ее в шприце, предварительно сняв (или загнув) иглу и надев на канюлю шприца защитный стерильный колпачок. Минимальный объем ПР, необходимое для выделения бактерий, 1-5 мл, грибов или микобактерий - не менее 10 мл. Избыток ПР или гной транспортируют в стерильных флаконах с крышкой, плотно завинчивающихся. При большом количестве материала проводят посев во флаконы аэробных и анаэробных со средой для гемокультурв объемном соотношении 1:3-1:10. Однако смешанные культуры в бульонных среде растут неодинаково, и появление быстрорастущих бактерий может маскировать микробы с замедленным ростом. Кроме того, становится невозможной прямая бактериоськопияПР и сроки идентификации бульонных культур удлиняют на сутки по сравнению с изолятами, выделенными при первичных посевах на плотные среды.

Взятие ПР тампоном предохраняет анаэробы от воздействия кислорода воздуха, не позволяет приготовить качественный препарат для микроскопии, не гарантирует выделения культуры при незначительном количестве микробов в образце. Нежелательно применять антикоагулянты (натрия цитрат), подавляющие рост некоторых видов бактерий, при необходимости лучше использовать гепарин.

Пунктат инфильтрата или абсцесса легких. Образцы получают при трансторакальной пункции под рентгенологическим контролем. Материал из абсцесса включает не только гной, но и ткань капсулы, отделяющую абсцесс. Навоз собирают шприцем, в котором его доставляют в лабораторию, или содержимое переносят в анаэробные системы для транспортировки. Использование тампонов, для взятия гноя на анаэробное исследованиязапрещено.

Биоптат легочной ткани.Трансбронхиальная и открытая биопсия легкого - наиболее агрессивные инвазивные методы, применение которых необходимо для диагностики оппортунистических инфекций у больных с иммунодефицитами. В результате появления результативных бронхоскопических методов БАЛ и ЗЩ к инвазивным методам стали прибегать значительно реже.

Открытая биопсия легкого позволяет получить необходимый объем ткани для гистологического и микробиологического исследований. Свежесрезанную поверхность используют для приготовления мазков - отпечатков с последующей окраской на легионеллы, пневмоцисты и грибы. Около 1/3 или 1/2 части образца измельчают в асептических условиях в ступке с абразивным веществом с помощью пестика, или в механическом гомогенизаторе.

Размельченную суспензию или экстракт гомогенизированной, используют для посева на легионеллы. Экстракт центрифугируют, из осадка готовят окрашенные мазки для выявления пневмоцист . Этот способ чувствителен для выявления цист P. jirovecii по сравнению с мазками-отпечатками или гистологическими препаратами целого легкого. Часть образца, которая осталась,размельчают (или гомогенизируют) для дальнейшего микроскопического изучения и культурального исследования суспензии (или экстракта) на бактерии, грибы, вирусы, микоплазмы, хламидии. Гомогенат можно использовать для изучения молекулярно-генетическими методами.

Кровь на гемокультуру. Кровь на гемокультуру целесообразно исследовать в первые 3-4 дня от начала заболевания, когда можно выделить гемокультуры при острой бактериальной пневмонии в 3-37% наблюдений. Необходим посев крови, взятой при двух раздельных венопункциях с интервалом в 30-40 мин, это снижает частоту ложноположительных результатов за счет бактерий - контаминантов кожи на 70%. Если в предшествующие 1-2 недели больному проводилась антимикробная терапия, кровь на посев берут 2-3 раза в сутки в течение 3 дней. Не следует собирать кровь из внутрисосудистых катетеров, кроме случаев, когда предполагают сепсис катетерного происхождения.

Кожу над пунктованойвеной тщательно обрабатывают 70% этиловым спиртом, затем 1-2 % настойкой йода в течение 30 с (обработку кожи начинают от центра будущего прокола по направлению к периферии). Дают высохнуть обработанному участку кожи, затем проводят венопункцию, после чего вновь обрабатывают участок 70% этиловым спиртом для удаления избытка йода, чтобы избежать раздражения кожи.

Посев осуществляют во флаконы с питательными средами для культивирования аэробов и анаэробов. Перед использованием флаконов визуально определяют прозрачность среды: любое помутнение свидетельствует о ее непригодности. Флаконы хранят в холодильнике, перед использованием (за 30-60 мин) - при комнатной температуре. Оптимальный объем крови для исследования у взрослых составляет 20-30 мл, соотношение крови и жидкой питательной среды должно быть 1:5-1:10. При отсутствии флаконов для гемокультур используют 20 мл шприц. В шприц заранее набирают 0,5-0,7 мл стерильного гепарина, заменяют иглу и затем пунктируют вену. Набирают 10 мл крови (для дополнительного исследования на анаэробы - 15 мл), перемешивают ее с гепарином осторожным покачиванием шприца (иглу из него не снимают ) и в этом же шприце с согнутой в подставке иглой немедленно отправляют в лабораторию. Посевы крови инкубируют не менее 7 дней и ежедневно контролируют наличие роста.

Моча. Пневмококки в моче можно обнаружить у 38% больных при пневмококковой пневмонии. Для посева исследуют утренние среднюю порцию свободно выпущенной мочи в объеме 3-5 мл, используя стерильные емкости. Чтобы избежать излишней ее контаминации при мочеиспускании нормальной микрофлорой нижних отделов мочеиспускательного и урогенитального тракта необходимо провести тщательный туалет наружных половых органов с мылом и кипяченой водой. Посев мочи следует проводить не позднее 2 часов после взятия материала или в течение 8 часов при условии ее хранения в холодильнике. Необходимо помнить, что при температуре +40 °С число бактерий в моче обычно остается стабильным в пределах 24 часов. Нежелательно исследовать мочу, полученную катетером. При наличии постоянного катетера протирают его наружное отверстие 70 % спиртом, затем шприцем с иглой через отверстие собирают мочу и переносят ее в стерильную емкость ( собирать мочу из мешка нельзя!).

При проведении скрининговых исследований на микобактерию туберкулеза мочу (в объеме не менее 20 мл) исследуют 3 дня подряд. Для проведения вирусологических исследований (на аденовирусы, ЦМВ) мочу в замороженном виде в объеме 10-15 мл немедленно доставляют в лабораторию. Мочу также исследуют на наличие пневмококкового и легионеллезного антигенов.

Мазки из носа, зева и смывов с ротоглотки. Образцы используют для выявления многих респираторных вирусов. Мазки из зева исследуют на наличие Chlamydiapneumoniae, Mycoplasmapneumoniae , Legionellaspp. с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Сыворотка крови. Образцы сыворотки крови изучают с помощью серологических методов в острый период инфекции и у реконвалесцентов для диагностики пневмоний, вызванных Legionellapneumophila, Chamydiapneumoniae, Chlamydiapsittaci, Mycoplasmapneumoniae, Streptococcuspneumoniae, вирусами и грибами.

Ø серологическая диагностика: выявление специфических АТ разных классов ( IgM , IgA , IgG ) в крови.

Ø реакции МП, агглютинации, ИФА, непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), РСК

Ø методика ПЦР - выявление ДНК или РНК патогенных вирусов и бактерий.