Явление рестрикции—модификации ДНК

В систему рестрикции—модификации входят ферменты, относящиеся к двум классам: одни из них модифицируют молекулы ДНК, находящиеся в клетке, а другие расщепляют чужеродные молекулы ДНК (или свои, не модифицированные) в этих же сайтах.

Впервые явление рестрикции—модификации обнаружено С. Лурия в 50-х гг. прошлого столетия в экспериментах по инфицированию бактерий E coli бактериофагом l. Оказалось, что бактериофаги, размноженные на бактериях одного штамма кишечной палочки, инфицировали клетки некоторых других штаммов с низкой эффективностью. Наблюдалось и обратное явление: полученные в ходе этого низкопродуктивного литического цикла фаги инфицировали клетки исходного штамма также плохо. Было высказано предположение, которое впоследствии подтвердилось, что фаговая ДНК подвергается в бактериях E. coli модификации, которая защищает ее от хозяйских ферментов рестрикции, но не от подобных ферментов в других штаммах.

В настоящее время известно, что модификацией, защищающей геном клетки и некоторые инфицирующие фаговые ДНК, является штамм-специфичное метилирование определенных азотистых оснований в ДНК. Причем ферментативное присоединение заместителей к азотистым основаниям происходит уже после включения соответствующих нуклеотидов в цепи ДНК, начиная с этапа образования фрагментов Оказаки. Метилируются нуклеотиды, занимающие строго определенное положение в молекуле, а ферменты, осуществляющие эти реакции, относятся к единой системе рестрикции—модификации. Ферменты рестрикции, входящие в такую систему, узнают в ДНК те же последовательности нуклеотидов и осуществляют специфическое расщепление ДНК в этих (либо прилегающих) последовательностях, если они не модифицированы.

Структура сайтов рестрикции—модификации расшифрована для более чем 200 рестрикционных ферментов.

Различают три типа эндонуклеаз рестрикции (I, II, III). Ферменты I и III типов обладают как нуклеазной, так и метилирующей активностями. При этом эндонуклеазы I типа узнают в ДНК определенную последовательность и разрезают двухцепочечную ДНК на разном (не фиксированном) расстоянии от сайтов узнавания. Эндонуклеазы типа III осуществляют двухцепочечные разрезы ДНК на расстоянии ~25 п. н. от своих сайтов узнавания. Только эндонуклеазы типа II производят двухцепочечные разрезы ДНК по специфическим фосфодиэфирным связям либо в пределах самого сайта узнавания, либо на небольшом, но вполне определенном удалении от него. Ферменты этого типа не обладают метилирующей активностью. Некоторые из эндонуклеаз II типа узнают специфические группы из четырех нуклеотидов, другие — гексануклеотидные последовательности, причем их общей особенностью является палиндромная структура (рис. 2.1). В этом случае одна и та же последовательность располагается в двух цепях в противоположных направлениях симметрично, относительно оси симметрии в середине палиндрома.

Как показано на рис. 2.1, результатом действия многих рестриктаз на молекулы ДНК, является разрезание их «уступом» в немодифицированных сайтах. При таком способе расщепления двухцепочечных ДНК образуются фрагменты, у которых имеется концевая избыточность, или так называемые «липкие» концы. В составе «липких» концов, образованных под действием дной рестриктазы, последовательности нуклеотидов комплементарны (рис. 2.1). Указанные особенности функционирования рестриктаз II типа делают их незаменимыми инструментами в генетической инженерии: это молекулярные ножницы, с помощью которых in vitro осуществляется фрагментирование ДНК.

В настоящее время рестрикционные ферменты выделены из более чем 400 штаммов бактерий, и для большей их части определена структура сайтов рестрикции. Система рестрикции—модификации может рассматриваться как своеобразный барьер, охраняющий клетку от включения в нее чужеродного генетического материала. Возникновение мутантов, лишенных способности к рестрикции, открывает дополнительные возможности для изменчивости у этих штаммов.

Недавно обнаружена способность некоторых конъюгативных плазмид и фагов преодолевать барьеры рестрикции клеток-хозяев, куда они попадают при конъюгации или инфекционном процессе. Это явление получило название антирестрикция. В геномах плазмид и фагов обнаружены гены ard, детерминирующие структуру белков-антирестриктаз. Эти белки ингибируют ферменты, принадлежащие к системе рестрикции—модификации типа I.